九州大学-研究者情報 [堀澤健一 (准教授) 生体防御医学研究所細胞機能制御学部門]

1.	堀澤健一、鈴木淳史, 生体の科学　特集　クロマチンによる転写制御機構の最前線 Ⅳ.転写制御と生命現象「ダイレクトリプログラミングと転写制御」, 医学書院, 第74巻　第3号, 2023.06.
2.	堀澤　健一、鈴木　淳史, ダイレクトリプログラミング最前線（鈴木淳史・編）　第2編第8章　ダイレクトリプログラミングを用いたがん細胞制御と腫瘍抑制, 株式会社　エヌ・ディー・エス, 2020.08.
3.	堀澤健一, 鈴木淳史, 細胞工学別冊　ダイレクトリプログラミング：目的細胞別　遺伝子導入・培養条件・機能解析リファレンス, 学研メディカル秀潤社, 2015.03.
4.	Noriko Tabata, Horisawa Kenichi, Hiroshi Yanagawa, “Chapter 4: Applications of the In Vitro Virus (IVV) Method for Various Protein Functional Analyses” Protein Engineering - Technology and Application, InTech, pp.85-110, 2013.05.
5.	Horisawa Kenichi, Hiroshi Yanagawa, “Chapter 10: Musashi Proteins in Neural Stem/Progenitor Cells” Neural Stem Cells and Therapy, InTech, pp.205-222, 2012.02.
6.	堀澤健一, 土居　信英, 「In vitro virus法」　ナノバイオ大事典テクノロジー編, テクノシステム, p.69, 2007.01.

主要原著論文

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1.	Takeshi Goya,Kenichi Horisawa,Miyako Udono,Yasuyuki Ohkawa,Yoshihiro Ogawa,Sayaka Sekiya,Atsushi Suzuki, Direct Conversion of Human Endothelial Cells Into Liver Cancer-Forming Cells Using Nonintegrative Episomal Vectors, Hepatology communications, 10.1002/hep4.1911, 2022.02, Liver cancer is an aggressive cancer associated with a poor prognosis. Development of therapeutic strategies for liver cancer requires fundamental research using suitable experimental models. Recent progress in direct reprogramming technology has enabled the generation of many types of cells that are difficult to obtain and provide a cellular resource in experimental models of human diseases. In this study, we aimed to establish a simple one-step method for inducing cells that can form malignant human liver tumors directly from healthy endothelial cells using nonintegrating episomal vectors. To screen for factors capable of inducing liver cancer-forming cells (LCCs), we selected nine genes and one short hairpin RNA that suppresses tumor protein p53 (TP53) expression and introduced them into human umbilical vein endothelial cells (HUVECs), using episomal vectors. To identify the essential factors, we examined the effect of changing the amounts and withdrawing individual factors. We then analyzed the proliferation, gene and protein expression, morphologic and chromosomal abnormality, transcriptome, and tumor formation ability of the induced cells. We found that a set of six factors, forkhead box A3 (FOXA3), hepatocyte nuclear factor homeobox 1A (HNF1A), HNF1B, lin-28 homolog B (LIN28B), MYCL proto-oncogene, bHLH transcription factor (L-MYC), and Kruppel-like factor 5 (KLF5), induced direct conversion of HUVECs into LCCs. The gene expression profile of these induced LCCs (iLCCs) was similar to that of human liver cancer cells, and these cells effectively formed tumors that resembled human combined hepatocellular–cholangiocarcinoma following transplantation into immunodeficient mice. Conclusion: We succeeded in the direct induction of iLCCs from HUVECs by using nonintegrating episomal vectors. iLCCs generated from patients with cancer and healthy volunteers will be useful for further advancements in cancer research and for developing methods for the diagnosis, treatment, and prognosis of liver cancer..
2.	Inada H., Udono M., Matsuda-Ito K., Horisawa K., Ohkawa Y., Miura S., Goya T., Yamamoto J., Nagasaki M., Ueno K., Saitou D., Suyama M., Maehara Y., Kumamaru W., Ogawa Y., Sekiya S., Suzuki A., Direct reprogramming of human umbilical vein- and peripheral blood-derived endothelial cells into hepatic progenitor cells., Nat comm, 10.1038/s41467-020-19041-z, 11, 5292, 2020.12, Recent advances have enabled the direct induction of human tissue-specific stem and pro- genitor cells from differentiated somatic cells. However, it is not known whether human hepatic progenitor cells (hHepPCs) can be generated from other cell types by direct lineage reprogramming with defined transcription factors. Here, we show that a set of three tran- scription factors, FOXA3, HNF1A, and HNF6, can induce human umbilical vein endothelial cells to directly acquire the properties of hHepPCs. These induced hHepPCs (hiHepPCs) propagate in long-term monolayer culture and differentiate into functional hepatocytes and cholangiocytes by forming cell aggregates and cystic epithelial spheroids, respectively, under three-dimensional culture conditions. After transplantation, hiHepPC-derived hepatocytes and cholangiocytes reconstitute damaged liver tissues and support hepatic function. The defined transcription factors also induce hiHepPCs from endothelial cells circulating in adult human peripheral blood. These expandable and bipotential hiHepPCs may be useful in the study and treatment of human liver diseases..
3.	Horisawa K., Udono M., Ueno K., Ohkawa Y., Nagasaki M., Sekiya S., Suzuki A., The Dynamics of Transcriptional Activation by Hepatic Reprogramming Factors., Mol Cell, 10.1016/j.molcel.2020.07.012, 79, 660-676, 2020.08, Specific combinations of two transcription factors (Hnf4a plus Foxa1, Foxa2, or Foxa3) can induce direct conversion of mouse fibroblasts into hepatocyte-like cells. However, the molecular mechanisms underlying hepatic reprogramming are largely unknown. Here, we show that the Foxa protein family members and Hnf4a sequentially and cooperatively bind to chromatin to activate liver-specific gene expression. Although all Foxa proteins bind to and open regions of closed chromatin as pioneer factors, Foxa3 has the unique potential of transferring from the distal to proximal regions of the transcription start site of target genes, binding RNA polymerase II, and co-traversing target genes. These distinctive characteristics of Foxa3 are essential for inducing the hepatic fate in fibroblasts. Similar functional coupling of transcription factors to RNA polymerase II may occur in other contexts whereby transcriptional activation can induce cell differentiation..
4.	Terada, Maiko; Kawamata, Masaki; Kimura, Ryota; Sekiya, Sayaka; Nagamatsu, Go; Hayashi, Katsuhiko; Horisawa, Kenichi; Suzuki, Atsushi, Generation of Nanog reporter mice that distinguish pluripotent stem cells from unipotent primordial germ cells, GENESIS, 10.1002/dvg.23334, 57, 11-12, 2019.11.
5.	Takashima Y, Horisawa K, Udono M, Ohkawa Y, Suzuki A., Prolonged inhibition of hepatocellular carcinoma cell proliferation by combinatorial expression of defined transcription factors., Cancer Sci., 10.1111/cas.13798., 109, 11, 3543-3553, 2018.11, Hepatocellular carcinoma (HCC) accounts for a large proportion of liver cancer cases and has an extremely poor prognosis. Therefore, novel innovative therapies for HCC are strongly desired. As gene therapy tools for HCC, 2 hepatic transcription factors (TF), HNF4A and HNF1A, have been used to suppress proliferation and to extinguish cancer-specific characteristics of target cells. However, our present data demon- strated that single transduction of HNF4A or HNF1A had only a limited effect on suppression of HCC cell proliferation. Thus, in this study, we examined whether com- binations of TF could show more effective antitumor activity, and found that combi- natorial transduction of 3 hepatic TF, HNF4A, HNF1A and FOXA3, suppressed HCC cell proliferation more stably than single transduction of these TF. The combinatorial transduction also suppressed cancer-specific phenotypes, such as anchorage- independent growth in culture and tumorigenicity after transplantation into mice. HCC cell lines transduced with the 3 TF did not recover their proliferative property after withdrawal of anticancer drugs, indicating that combinatorial expression of the 3 TF suppressed the growth of all cell subtypes within the HCC cell lines, including cancer stem-like cells. Transcriptome analyses revealed that the expression levels of a specific gene set involved in cell proliferation were only decreased in HCC cells overexpressing all 3 TF. Moreover, combined transduction of the 3 TF could facilitate hepatic differentiation of HCC cell lines. Our strategy for inducing stable inhibition and functional differentiation of tumor cells using a defined set of TF will become an effective therapeutic strategy for various types of cancers..
6.	Maiko Terada, Horisawa K, Shizuka Miura, 高島康郎, Ohkawa, Y, Sayaka Sekiya, 松田花菜江, Atsushi Suzuki, Kupffer cells induce Notch-mediated hepatocyte conversion in a common mouse model of intrahepatic cholangiocarcinoma., Sci Rep., doi: 10.1038/srep34691., 6, 34691-34691, 2016.10, Intrahepatic cholangiocarcinoma (ICC) is a malignant epithelial neoplasm composed of cells resembling cholangiocytes that line the intrahepatic bile ducts in portal areas of the hepatic lobule. Although ICC has been defined as a tumor arising from cholangiocyte transformation, recent evidence from genetic lineage-tracing experiments has indicated that hepatocytes can be a cellular origin of ICC by directly changing their fate to that of biliary lineage cells. Notch signaling has been identified as an essential factor for hepatocyte conversion into biliary lineage cells at the onset of ICC. However, the mechanisms underlying Notch signal activation in hepatocytes remain unclear. Here, using a mouse model of ICC, we found that hepatic macrophages called Kupffer cells transiently congregate around the central veins in the liver and express the Notch ligand Jagged-1 coincident with Notch activation in pericentral hepatocytes. Depletion of Kupffer cells prevents the Notch-mediated cell-fate conversion of hepatocytes to biliary lineage cells, inducing hepatocyte apoptosis and increasing mortality in mice. These findings will be useful for uncovering the pathogenic mechanism of ICC and developing prevenient and therapeutic strategies for this refractory disease..
7.	Niikura K, Horisawa K, Doi N, Endosomal escape efficiency of fusogenic B18 and B55 peptides fused with anti-EGFR single chain Fv as estimated by nuclear translocation., J Biochem., 10.1093/jb/mvv083., 159, 1, 123-132, 2016.01.
8.	Niikura K, Horisawa K, Doi N, A fusogenic peptide from a sea urchin fertilization protein promotes intracellular delivery of biomacromolecules by facilitating endosomal escape., J Control Release, 10.1016/j.jconrel.2015.06.020, 212, 85-93, 2015.08.
9.	Chiku M., Horisawa K., Doi N., Yanagawa H., Einaga Y., Electrochemical detection of tyrosine derivatives and protein tyrosine kinase activity using boron-doped diamond electrodes, BIOSENSORS & BIOELECTRONICS, 10.1016/j.bios.2010.06.027, 26, 1, 235-240, 2010.09.
10.	Horisawa K., Imai T., Okano H., Yanagawa H., 3 '-Untranslated region of doublecortin mRNA is a binding target of the Musashi1 RNA-binding protein, FEBS LETTERS, 10.1016/j.febslet.2009.06.045, 583, 14, 2429-2434, 2009.07.
11.	Horisawa K., Doi N., Yanagawa H., Use of cDNA Tiling Arrays for Identifying Protein Interactions Selected by In Vitro Display Technologies, PLOS ONE, 10.1371/journal.pone.0001646, 3, 2, e1646, 2008.02.
12.	Tateyama S., Horisawa K., Takashima H., Miyamoto-Sato E., Doi N., Yanagawa H., Affinity selection of DNA-binding protein complexes using mRNA display, NUCLEIC ACIDS RESEARCH, 10.1093/nar/gnj025, 34, 3, e27, 2006.02.
13.	Miyamoto-Sato E., Ishizaka M., Horisawa K., Tateyama S., Takashima H., Fuse S., Sue K., Hirai N., Masuoka K., Yanagawa H., Cell-free cotranslation and selection using in vitro virus for high-throughput analysis of protein-protein interactions and complexes, GENOME RESEARCH, 10.1101/gr.3510505, 15, 5, 710-717, 2005.05.
14.	Horisawa K., Doi N., Takashima H., Yanagawa H., Application of quantitative real-time PCR for monitoring the process of enrichment of clones on in vitro protein selection, JOURNAL OF BIOCHEMISTRY, 137, 2, 121-124, 2005.02.
15.	Horisawa K., Tateyama S., Ishizaka M., Matsumura N., Takashima H., Miyamoto-Sato E., Doi N., Yanagawa H., In vitro selection of Jun-associated proteins using mRNA display, NUCLEIC ACIDS RESEARCH, 10.1093/nar/gnh167, 32, 21, e169, 2004.12.
16.	Miyamoto-Sato E., Takashima H., Fuse S., Sue K., Ishizaka M., Tateyama S., Horisawa K., Sawasaki T., Endo Y., Yanagawa H., Highly stable and efficient mRNA templates for mRNA-protein fusions and C-terminally labeled proteins, NUCLEIC ACIDS RESEARCH, 10.1093/nar/gng078, 31, 15, e78, 2003.08.

主要総説, 論評, 解説, 書評, 報告書等

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1.	Kenichi Horisawa, Atsushi Suzuki, The role of pioneer transcription factors in the induction of direct cellular reprogramming, Regenerative Therapy, https://doi.org/10.1016/j.reth.2023.06.002, 2023.06, Regenerative medicine is a highly advanced medical field that aims to restore tissues and organs lost due to diseases and injury using a person's own cells or those of others. Direct cellular reprogramming is a promising technology that can directly induce cell-fate conversion from terminally differentiated cells to other cell types and is expected to play a pivotal role in applications in regenerative medicine. The induction of direct cellular reprogramming requires one or more master transcription factors with the potential to reconstitute cell type-specific transcription factor networks. The set of master transcription factors may contain unique transcription factors called pioneer factors that can open compacted chromatin structures and drive the transcriptional activation of target genes. Therefore, pioneer factors may play a central role in direct cellular reprogramming. However, our understanding of the molecular mechanisms by which pioneer factors induce cell-fate conversion is still limited. This review briefly summarizes the outcomes of recent findings and discusses future perspectives, focusing on the role of pioneer factors in direct cellular reprogramming..
2.	Kenichi Horisawa, Atsushi Suzuki, Direct cell-fate conversion of somatic cells: Toward regenerative medicine and industries, Proceedings of the Japan Academy, Ser. B, Physical and Biological Sciences, https://doi.org/10.2183/pjab.96.012, 2020.04, Cells of multicellular organisms have diverse characteristics despite having the same genetic identity. The distinctive phenotype of each cell is determined by molecular mechanisms such as epigenetic changes that occur throughout the lifetime of an individual. Recently, technologies that enable modification of the fate of somatic cells have been developed, and the number of studies using these technologies has increased drastically in the last decade. Various cell types, including neuronal cells, cardiomyocytes, and hepatocytes, have been generated using these technologies. Although most direct reprogramming methods employ forced transduction of a defined sets of transcription factors to reprogram cells in a manner similar to induced pluripotent cell technology, many other strategies, such as methods utilizing chemical compounds and microRNAs to change the fate of somatic cells, have also been developed. In this review, we summarize transcription factor-based reprogramming and various other reprogramming methods. Additionally, we describe the various industrial applications of direct reprogramming technologies..
3.	Horisawa Kenichi, Atsushi SUZUKI, Cell-Based Regenerative Therapy for Liver Disease, Innovative Medicine Basic Research and Development, Springer, 2015.10, [URL].
4.	堀澤健一, Specific and quantitative labeling of biomolecules using click chemistry., Front Physiol., 2014.11.
5.	Horisawa Kenichi, Takao Imai, Hideyuki Okano, Hiroshi Yanagawa, The Musashi family RNA-binding proteins in stem cells, Biomolecular Concepts, 2010.03.

主要学会発表等

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1.	堀澤健一鈴木淳史, 細胞運命の直接転換と形質維持に関する転写因子の役割, 第96回日本生化学会大会, 2023.11, ダイレクトリプログラミングは、iPS細胞の様な初期化状態を経ることなく、終末分化した体細胞から他の系譜の細胞を直接分化誘導する技術であり、細胞移植療法などの医療への応用が期待されている。準備できる細胞の量や、分化誘導に際しての時間的・費用的コストなどの点でiPS細胞に対して優位性があるだけでなく、生体内においてin situで標的細胞を誘導する手法も開発されており、iPS細胞を補完する次世代の再生医療技術として旺盛に研究が進められている。ダイレクトリプログラミングは多くの場合、標的細胞の分化や機能維持に関与する転写因子のセットを異所的に強制発現することで実現する。我々が研究を進めている誘導肝細胞様細胞（iHepC）においては、Hnf4aに加えてFoxa1、Foxa2、Foxa3のいずれか１つを導入することにより細胞運命の人為的な転換を引き起こすことができる。これまでの我々の研究によって、Hnf4aとFoxaが協調的に働くメカニズムが明らかになってきた。特にパイオニア因子として知られるFoxaの文字通り先導的なクロマチン結合は、標的遺伝子の制御領域に結合してクロマチンを弛緩させ、それに続いて共結合因子であるHnf4aを近傍にリクルートし転写を活性化させるという、リプログラミング進行のトリガーであることが示された。しかし、導入転写因子の働きにはまだ不明な部分も多い。例えば、リプログラミング過程で転写が抑制される遺伝子に対してもFoxaの結合は見られるが、その制御に直接的に関与しているのか？転写制御の際にクロマチン状態をどのように変化させているのか？導入されたホスト体細胞内において、制御対象とする標的遺伝子をどの様に選別しているのか？分化転換後の細胞の機能維持に対してどのような影響を与えているのか？など、まだ非常に多くの謎が残されている。本発表では、iHepCに対する次世代シークエンサー解析を主体とした様々な解析から解き明かされてきた、導入転写因子の挙動や働きについて紹介し、ダイレクトリプログラミングにおける転写因子セットの役割について議論したい。.
2.	Ryoga Suzuki , Kenichi Horisawa , Shizuka Miura , Yasuyuki Ohkawa , Atsushi Suzuki, Elucidation of Reprogramming Mechanism in Induced Fetal Intestinal Progenitor Cells, 第24回生医研リトリート2022, 2022.07.
3.	堀澤健一、三浦静、荒木啓充、三浦史仁、伊藤隆司、鈴木淳史 , 誘導腸幹細胞の線維芽細胞からの直接誘導過程におけるエピジェネティックリモデリングの解析, 第15回日本エピジェネティクス研究会年会, 2022.06, ダイレクトリプログラミングとは、初期化を経ずに目的の細胞を直接誘導する技術であり、再生医療など幅広い分野での応用が期待されている。我々は、マウス胎仔線維芽細胞（MEF）にFoxa3/Cdx2/Gata6/Hnf4aの4つの転写因子を強制発現し、特定培養条件下で分化誘導させることにより、生体由来の腸幹細胞（ISC）と同じ様に腸上皮オルガノイドを形成できる成体型誘導腸幹細胞（iISC）の作製に成功した（Miura & Suzuki, 2017）。iISC由来の腸上皮オルガノイドは、その形態や遺伝子発現がISC由来オルガノイドに酷似しているだけでなく、全ての腸上皮組織構成細胞への多分化能と自己複製能、移植マウスにおける組織再構築能を有していた。 iPS細胞の誘導過程では大規模なDNA脱メチル化を始めとするドラスティックなエピゲノムのリモデリングが起こることが知られる（Kim et al., 2010）。一方でダイレクトリプログラミング過程におけるエピジェネティックリモデリングはまだ報告が少なく、それぞれの細胞への分化誘導過程において何が起こるのか不明な部分が多い。そこで本研究では、MEF、ISC、iISCの3種類の細胞について、Post-bisulfite adaptor-tagging (PBAT)法によるメチローム解析を行い、リプログラミング時のDNAメチル化の変動や生体由来細胞との差異、転写への影響などについて詳細な比較解析を行なった。その結果、iISCリプログラミングではDNAメチル化、脱メチル化がそれぞれ同時に進行し、ISCと類似したメチル化状態に収束することが分かった。.
4.	堀澤健一, 鈴木淳史, 肝細胞へのダイレクトリプログラミングにおける転写因子機能の解析, 第38回染色体ワークショップ・第19回核ダイナミクス研究会, 2021.01, ダイレクトリプログラミングは体細胞から直接、他系譜の細胞を誘導する技術であり、再生医療分野などへの応用が期待されている。多くの場合、細胞の運命転換を人工的に誘導するために、転写因子セットの強制発現という手法が用いられる。異所的に発現した複数種の転写因子が、互いにどの様に影響し合い、クロマチンに対してどの様にアプローチをすることで分化誘導を引き起こしているのか、その分子機序は未だ不明な部分が多い。本研究ではHnf4αおよびFoxa1,2,3のいずれか１つという、２種の転写因子を導入することで誘導される誘導肝細胞様細胞（iHep細胞）をモデルとして[1]、ダイレクトリプログラミングの際に核内で起こるダイナミックな変化の解明を目標とした。導入した２種の転写因子、種々のヒストン修飾、RNAポリメラーゼII（Pol2）を標的としたChIP-seqやFAIRE-seqを行うことで、クロマチン状態の変化や転写関連分子の局在・挙動を解析すると同時に、RNA-seqによるトランスクリプトームの時系列的変化を計測することで、ダイレクトリプログラミング時の核内ダイナミクスを重層的なデータから解析した。その結果、Foxaがパイオニア因子として働きクロマチンを開放することが、Hnf4αの結合を促進させ肝臓関連遺伝子の発現を亢進するという、あらかじめ予測された分子機構を実験的に確認することができた。また、リプログラミング過程で転写因子の結合位置が動的に変化することや、Foxa1および2が遺伝子遠位のエンハンサーと思われる部位に結合するのに対してFoxa3は遺伝子近位のプロモーター部位に結合すること、その様に結合部位が全く異なるにもかかわらず全てのFoxaがほぼ同じ遺伝子セットを標的とすること、Foxa3はPol2と連動してgenebody上を移動することで転写誘導を行なっていることなど、多くの新規の分子メカニズムを明らかにすることができた[2]。今回はそのなかでも特に、Foxaファミリー間の分子挙動の差異とFoxa3の特徴的な転写亢進の分子メカニズムについて紹介する。 [1] Sekiya S. & Suzuki A., (2011) Nature, 475, 390-393. [2] Horisawa K. et al., (2020) Mol. Cell, 79, 660-676. .
5.	堀澤健一, 鈴木淳史, 肝細胞誘導転写因子のダイナミクス解析, 第14回日本エピジェネティクス研究会年会, 2021.03, ダイレクトリプログラミングは体細胞から直接、他系譜の細胞を誘導する技術であり、再生医療分野などへの応用が期待されている。細胞の分化転換のために転写因子セットの強制発現が行われるが、異所的に発現した転写因子が互いにどの様に影響し合いクロマチンににアプローチすることで分化誘導を引き起こしているのか、その分子機序の多くは不明である。本研究ではHnf4αおよびFoxa1,2,3のいずれか１つという、２種の転写因子により誘導される誘導肝細胞様細胞（iHep細胞）をモデルとした。導入した転写因子、ヒストン修飾、RNAポリメラーゼII（Pol2）のChIP-seqやFAIRE-seqを行うことで、クロマチン状態の変化や転写因子の局在・挙動を解析すると同時に、RNA-seqによる転写状態の時系列的変化を計測することで、リプログラミング時の核内ダイナミクスを重層的なデータから解析した。その結果、Foxaがパイオニア因子として働きクロマチンを開放することが、Hnf4αの結合を促進させ肝臓関連遺伝子の発現を亢進するという、予測された分子機構を確認することができた。また、リプログラミング過程で転写因子の結合位置が動的に変化することや、Foxa1／2が遺伝子遠位の制御領域に結合するのに対してFoxa3は遺伝子近位のプロモーター部位に結合すること、その様に結合部位が全く異なるにもかかわらず全てのFoxaがほぼ同じ遺伝子セットを標的とすること、Foxa3がPol2と物理的に連動してgenebody上を移動し転写誘導を行なっていることなど、多くの新規の分子メカニズムを明らかにすることができた。 .
6.	従野雅義、堀澤　健一、鈴木　淳史, 肝細胞への直接運命転換における解析, 細胞ダイバース第３回若手ワークショップ, 2020.02, 肝臓は代謝や解毒など生命の維持に必要不可欠な機能を担っている臓器であるが、一度肝硬変になってしまうと正常肝に戻すことが困難であり、末期肝がんや、急性肝不全など肝機能の回復が必要な患者に対して生体肝移植がほぼ唯一の治療法となっている。しかし、ドナーへの侵襲性の高さや、移植した細胞への免疫反応などの問題から、代替治療法の開発が期待されている。これらの問題点を解決し得る 1 つの手法が、患者本人の細胞からダイレクトリプログラミング法や人工多能性幹細胞(induced pluripotent stem cells: iPS 細胞)を介して作製した肝細胞を利用した細胞移植療法である。所属研究室では、ダイレクトリプログラミング法を用いて、マウスの線維芽細胞に肝臓の発生・分化に必須な転写因子である Foxa1, 2, 3 のいずれか 1 つと Hnf4αを導入することで、肝細胞様細胞(induced hepatocyte-like cells: iHep 細胞)の作製に世界で初めて成功した。iHep 細胞は生体の肝細胞と似た性質を持ち、細胞移植や薬剤代謝試験などに使用できることから、肝疾患治療や薬剤開発への貢献が期待される。しかし、iHep 細胞へのダイレクトリプログラミングの過程における分子機序についてはほとんどが明らかとなっていない。そこで、私たちは分子機序の解明を目的に様々な解析を行ってきた。本ワークショップでは、その結果についてご紹介したい。.
7.	堀澤健一三浦静和泉自泰馬場健史鈴木淳史, Trans-omic analysis for metabolic remodeling during liver regeneration, 細胞ダイバース第３回若手ワークショップ, 2020.02, The liver is the central metabolic organ that produces energy for life activities and detoxifies various extrinsic and intrinsic harmful substances. Also, the liver is one of the organs capable of regeneration. After deletion of two-thirds of the total liver mass, the remaining liver tissue immediately enlarge and recover hepatic function. Remodeling of the metabolic process in the injured liver is a candidate of the responsible mechanism regulating liver regeneration. It is known that the concentration of various metabolites from the central metabolic pathways affects cellular states through the extensive epigenetic change of chromatin. Also, several metabolites including a group of lipid-derived molecules eicosanoids are known to work as signal mediators for cell proliferation. Moreover, because regenerative potential of the liver attenuates in the aging process, comparison of the regenerating livers between young and old mice could elucidate the molecular mechanism of liver regeneration. Thus, in this study, we performed a metabolomic analysis using liver samples obtained from young and old mice before and after the partial hepatectomy to elucidate the molecular machinery and discover the key metabolites regulating liver regeneration. In addition, we performed a trans-omic analysis using our metabolome data and a public transcriptome data set obtained from the regenerating liver. We present the data in this symposium and hope a lively discussion..
8.	Kenichi Horisawa, Shizuka Miura, Yoshihiro Izumi, Takeshi Bamba, Atsushi Suzuki, Trans-omic analysis for metabolic remodeling during liver regeneration, The 29th Hot Spring Harbor International Symposium, 2020.02, The liver is the central metabolic organ that produces energy for life activities and detoxifies various extrinsic and intrinsic harmful substances. Also, the liver is one of the organs capable of regeneration. After deletion of two-thirds of the total liver mass, the remaining liver tissue immediately enlarge and recover hepatic function. Remodeling of the metabolic process in the injured liver is a candidate of the responsible mechanism regulating liver regeneration. It is known that the concentration of various metabolites from the central metabolic pathways affects cellular states through the extensive epigenetic change of chromatin. Also, several metabolites including a group of lipid-derived molecules eicosanoids are known to work as signal mediators for cell proliferation. Moreover, because regenerative potential of the liver attenuates in the aging process, comparison of the regenerating livers between young and old mice could elucidate the molecular mechanism of liver regeneration. Thus, in this study, we performed a metabolomic analysis using liver samples obtained from young and old mice before and after the partial hepatectomy to elucidate the molecular machinery and discover the key metabolites regulating liver regeneration. In addition, we performed a trans-omic analysis using our metabolome data and a public transcriptome data set obtained from the regenerating liver. We present the data in this symposium and hope a lively discussion..
9.	堀澤健一三浦静鈴木淳史, 部分肝切除後の肝再生に伴う代謝変動のメタボローム解析, 新学術領域研究「クロマチン潜在能」第１回ワークショップ, 2019.06.
10.	従野雅義、堀澤健一、鈴木淳史, 肝細胞へのダイレクトリプログラミングを阻害する転写因子の同定, 新学術領域研究「クロマチン潜在能」第１回ワークショップ, 2019.06.
11.	堀澤健一三浦静鈴木淳史, 肝再生に伴う脂質代謝変動のリピドーム解析, 新学術領域研究「細胞社会ダイバーシティーの統合的解明と制御」第4回公開シンポジウム, 2019.06.
12.	堀澤健一,植野和子,関谷明香,成相直樹,長﨑正朗,大川恭行,鈴木淳史, 肝細胞様細胞へのダイレクトリプログラミングにおける発現変動遺伝子座のエピゲノム解析, AMED-CREST「エピゲノム」領域会議, 2015.02, 我々は、マウス胎仔線維芽細胞(MEF)にHnf4αおよびFoxA1~3のいずれかの2転写因子を強制発現することで、肝細胞様の性質を有するinduced hepatocyte-like cell(iHep細胞)の誘導に成功した。しかしダイレクトリプログラミング過程、また樹立したiHep細胞におけるエピジェネティックな状態は全く不明であった。そこで我々は、樹立したiHep細胞、および誘導過程(遺伝子導入48時間後)のiHep細胞を解析対象とし、ヒストン修飾を始めとする多数のエピジェネティックマークに対する大規模なChIP-Seq解析、およびRNA-Seqによる発現解析を行った。その結果、肝細胞に類似したiHep細胞の遺伝子発現プロファイルと、リプログラム過程におけるH3K4me3、H3K27me3を始めとしたヒストン修飾の大規模変動を明らかにすることができた(口頭発表:鈴木淳史)。本発表では、それらのデータを可視化して様々な遺伝子座で行った詳細な解析のうち、肝細胞およびMEFに特徴的に発現する代表的な遺伝子のlocusについての解析結果を報告する。この結果をもとにリプログラミング誘導因子と遺伝子発現変動、ヒストン修飾などとの関連性について議論を深めたい。.
13.	堀澤健一,植野和子,関谷明香,成相直樹,長﨑正朗,大川恭行,鈴木淳史, iHep細胞の誘導過程における H3K4me3/H3K27me3 bivalent状態の解析, AMED-CREST「エピゲノム」領域会議, 2016.01, 我々は、体細胞に2つの転写因子(Hnf4a および Foxa1, 2 または 3)を強制発現することで、iPS 細胞の様な初期化状態を経ることなく、分化した肝細胞様の細胞(iHep 細胞)を in vitro で直接誘導することに成功した。この様な細胞の人為的分化転換技術は「ダイレクトリプログラミング」と呼ばれ、再生医療への応用が期待されている。しかし、転写因子の強制発現後、どのような細胞内の変化が iHep 細胞の分化を引き起こすのか、詳細なメカニズムはほとんど明らかになっていなかった。我々は、転写因子導入に起因するエピゲノム変動が、ダイレクトリプログラミングを理解する鍵であると考え、ChIP-Seq を中心としたエピゲノム解析を推進してきた。その結果、転写因子導入から 48 時間後のリプログラミング初期の細胞(右図 , 48hr)において、H3K4me3 および H3K27me3 シグナルが共に上昇した bivalent 領域が生じ、iHep 細胞の樹立に伴いその bivalent 状態が解消される可能性が示唆された。そこで本研究では、bivalent 領域を有する代表的な細胞である ES および iPS 細胞とのエピゲノムの比較を行うと共に、bivalent 状態の誘導が強制発現した転写因子のゲノムへの結合に起因するものかを検証した。また、 Proximity ligation assay(PLA)を行い、転写因子導入 48 時間後の細胞における bivalent 領域の増減を実験的にも検証した。.
14.	堀澤健一,植野和子,関谷明香,成相直樹,長﨑正朗,大川恭行,鈴木淳史, 体細胞から肝細胞様細胞を誘導する転写因子の挙動および機能の解析, AMED-CREST「エピゲノム」領域会議, 2017.02, 我々は、2つの転写因子(Hnf4a および Foxa1, 2 または 3)を分化した体細胞に強制発現することで、iPS 細胞の様な初期化状態を経ることなく、肝細胞様の性質を有する細胞(iHep 細胞)を直接的に誘導することに成功した。この様な細胞の人為的分化転換技術は「ダイレクトリプログラミング」と呼ばれ、再生医療への応用が期待されている。しかし、強制発現した転写因子がゲノム上で時空間的にどのような挙動を取り、最終的に iHep 細胞の分化を引き起こすのか、その分子メカニズムはほとんど明らかになっていなかった。そのため我々は、 iHep 細胞のダイレクトリプログラミング現象の包括的な理解を目指し、リプログラミング過程にける導入転写因子の挙動、クロマチン状態および遺伝子発現変動の解析を、次世代シークエンサーを用いることでゲノムワイドに行った。その結果、Foxa が先行して標的部位に結合し、続いてリクルートした Hnf4a と協調的に働くことで肝細胞特異的な遺伝子発現状態を惹起するという、iHep 細胞誘導の分子メカニズムの一端を明らかにした。また、これまで相同的に働くと考えられてきた Foxa ファミリー転写因子が、ファミリー間で非常に異なる挙動を示しつつも、最終的には同じ肝細胞特異的遺伝子セットの発現を活性化することも見出した。今回得られた知見は、高効率かつ安全なヒト iHep 細胞樹立を実現するうえで重要な情報であり、再生医療への貢献が期待される。.

特許出願・取得

特許出願件数 2件

特許登録件数 1件

学会活動

所属学会名

日本エピジェネティクス研究会

日本プロテオーム学会

日本RNA学会

日本分子生物学会

学会大会・会議・シンポジウム等における役割

2023.07.28～2023.07.29, 第25回生医研リトリート, 座長.

2022.07.11～2022.07.12, 第24回生医研リトリート, 座長.

2017.12.27～2017.12.27, 応用幹細胞リトリート2017・Winter, 運営幹事.

2016.07.11～2016.07.12, 第19回生医研リトリート2016, 運営.

2017.10.31～2017.11.01, The 27th Hot Spring Harbor International Symposium Frontiers in Stem Cell Research and Reprogramming, 運営.

学会誌・雑誌・著書の編集への参加状況

2018.04～2022.03, Journal of Biochemistry, 国際, Advisory Board（編集参与）.

学術論文等の審査

年度	外国語雑誌査読論文数	合計
2015年度	1	1
2016年度	1	1
2018年度	4	4
2019年度	2	2
2020年度	1	1
2021年度	2	2

受賞

上原記念生命科学財団　研究助成金, 2022.03.

臨床医学振興財団　医学研究資金助成, 2021.12.

日揮・実吉奨学会　研究助成, 2010.06.

武田科学振興財団　一般研究奨励, 2008.11.

Certificate, ２１世紀COEプログラム「システム生物学による生命機能の理解と制御」, 2006.08.

研究資金

科学研究費補助金の採択状況(文部科学省、日本学術振興会)

2023年度～2023年度, 基盤研究(C), 代表, 転写因子発現の厳密な制御に基づく再現性の高いダイレクトリプログラミング技術の創出.

2016年度～2018年度, 基盤研究(C), 代表, 脂質代謝が駆動する転写活性化とダイレクトリプログラミングの解析.

2012年度～2014年度, 基盤研究(C), 代表, 未分化維持因子Musashi1による神経細胞の分化・回路形成制御の解析.

2012年度～2013年度, 新学術領域研究, 代表, ケミカルプローブによるメチル化標的転写因子のプロテオミクス解析.

2008年度～2009年度, 若手研究(B), 代表, アルギニンメチル化酵素群における標的タンパク質の網羅的探索技術の開発.

競争的資金(受託研究を含む)の採択状況

2005年度～2005年度, JST　シーズ育成試験, 代表, IVV法とタイリングアレイ技術による機能性蛋白質の高感度探索手法の開発.

2008年度～2008年度, 文部科学省　ハイテクリサーチセンター整備事業, 分担, 慶應義塾大学医学部再生医学・治療研究開発センタープロジェクト（研究代表：福田恵一）.

2009年度～2009年度, JST シーズ発掘試験 A発掘型, 代表, In vitro virus法を用いた翻訳後修飾酵素の標的探索技術の開発.

寄附金の受入状況

2005年度, 慶應義塾大学, 異分野連携研究助成／ダイマーを形成する転写因子ネットワークの解析.

2008年度, 武田科学振興財団, 一般研究奨励／アルギニンメチル化酵素群における標的タンパク質の網羅的探索技術の開発.

2010年度, 日揮・実吉奨学会, 研究助成／メチルプロテオームの解明に向けたアルギニンメチル化標的タンパク質の特異的選択技術の開発.

2010年度, 慶應義塾大学, 学事振興資金個人研究A／神経幹細胞におけるMusashi1蛋白質新規標的Dccの発現制御の解明.

2021年度, 上原記念生命科学財団, 研究助成金／ダイレクトリプログラミングの転写収斂メカニズム解析.

2021年度, 臨床医学振興財団, 医学研究資金助成／再生医療の実現に向けた肝細胞ダイレクトリプログラミングにおける転写収斂メカニズムの解析.

学内資金・基金等への採択状況

2016年度～2016年度, QRプログラム（わかば）, 代表, クロマチン制御を介したダイレクトリプログラミング機構の解明.

2014年度～2014年度, 九州大学P&P・Aタイプ, 分担, ゲノム・エピゲノム研究拠点形成.

九大関連コンテンツ

pure2017年10月2日から、「九州大学研究者情報」を補完するデータベースとして、Elsevier社の「Pure」による研究業績の公開を開始しました。

QIR　九州大学学術情報リポジトリシステム情報科学研究院

生体防御医学研究所


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