記述言語：英語   出版者・発行元：Inflammation  

Nuclear factor-κB (NF-κB) is a transcription factor that regulates the expression of various genes involved in inflammatory diseases and immune responses. Recently, a novel transcriptional regulatory mechanism of NF-κB involving the phosphorylation of serine 536 (534 in mice; S534) of its p65 subunit was reported; however, further research is required to elucidate the physiological role of S534 phosphorylation. Therefore, we generated S534A knock-in (KI) mice, in which the S534 of p65 was substituted with alanine. Similar to the wild-type (WT) mice, S534A KI mice developed normally. After stimulation with tumor necrosis factor α (TNFα), mouse embryonic fibroblasts (MEFs) derived from S534A KI mice exhibited increased target gene expression compared with that in the WT MEFs, which was induced by long-term binding of p65 to DNA. According to comprehensive gene expression analysis after stimulation with TNFα, the expression of genes p65ted to inflammatory and immune responses was increased, and the expression of genes p65ted to lipolysis was decreased in S534A KI MEFs. Analyses of a periodontal disease model established using WT and S534A KI mice revealed that alveolar bone resorption was enhanced in S534A KI mice owing to an increase in the number of osteoclasts, which was not attributed to the differentiation of osteoclast precursor cells but to an increased expression of interleukin-1β and receptor activator of NF-κB ligand in the periodontal tissue. Hence, phosphorylation of S536 negatively regulates inflammatory responses in vitro and in vivo.

DOI： 10.1007/s10753-024-02140-0

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記述言語：英語   出版者・発行元：Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease  

Postmenopausal women experience bone loss and weight gain. To date, crosstalk between estrogen receptor signals and nuclear factor-κB (NF-κB) has been reported, and estrogen depletion enhances bone resorption by osteoclasts via NF-κB activation. However, it is unclear when and in which tissues NF-κB is activated after menopause, and how NF-κB acts as a common signaling molecule for postmenopausal weight gain and bone loss. Therefore, we examined the role of NF-κB in bone and energy metabolism following menopause. NF-κB reporter mice, which can be used to measure NF-κB activation in vivo, were ovariectomized (OVX) and the luminescence intensity after OVX increased in the metaphyses of the long bones and perigonadal white adipose tissue, but not in the other tissues. OVX was performed on wild-type (WT) and p65 mutant knock-in (S534A) mice, whose mutation enhances the transcriptional activity of NF-κB. Weight gain with worsening glucose tolerance was significant in S534A mice after OVX compared with those of WT mice. The bone density of the sham group in WT or S534A mice did not change, whereas in the S534A-OVX group it significantly decreased due to the suppression of bone formation and increase in bone marrow adipocytes. Disulfiram, an anti-alcoholic drug, suppressed OVX-induced activation of NF-κB in the metaphyses of long bones and white adipose tissue (WAT), as well as weight gain and bone loss. Overall, the activation of NF-κB in the metaphyses of long bones and WAT after OVX regulates post-OVX weight gain and bone loss.

DOI： 10.1016/j.bbadis.2024.167320

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記述言語：英語   出版者・発行元：Frontiers Media  

Periodontal disease is an infectious disease that affects many people worldwide. Disease progression destroys the alveolar bone and causes tooth loss. We have previously shown that alymphoplasia (aly/aly) mice harboring a loss-of-function mutation in the map3k14 gene, which is involved in p100 to p52 processing of the alternative NF-κB pathway, exhibited mild osteopetrosis due to decreased number of osteoclasts, suggesting the alternative NF-κB pathway as a potential drug target for the amelioration of bone disease. In the present study, wild-type (WT) and aly/aly mice were subjected to silk ligation to establish a periodontitis model. Alveolar bone resorption was suppressed in aly/aly mice by decreased numbers of osteoclasts in the alveolar bone in comparison to WT mice. Furthermore, the expression of receptor activator of NF-κB ligand (RANKL) and TNFα (cytokines involved in osteoclast induction in periligative gingival tissue) was decreased. When primary osteoblasts (POBs) and bone marrow cells (BMCs) derived from WT and aly/aly mice were prepared and co-cultured, osteoclasts were induced from WT-derived BMCs, regardless of the origin of the POBs, but hardly formed from aly/aly mouse-derived BMCs. Furthermore, the local administration of an NIK inhibitor, Cpd33, inhibited osteoclast formation and thereby inhibited alveolar bone resorption in the periodontitis model. Therefore, the NIK-mediated NF-κB alternative pathway can be a therapeutic target for periodontal disease.

CiNii Research

記述言語：英語   掲載種別：研究論文（学術雑誌）   出版者・発行元：Frontiers in Immunology  

Periodontal disease is an infectious disease that affects many people worldwide. Disease progression destroys the alveolar bone and causes tooth loss. We have previously shown that alymphoplasia (aly/aly) mice harboring a loss-of-function mutation in the map3k14 gene, which is involved in p100 to p52 processing of the alternative NF-kB pathway, exhibited mild osteopetrosis due to decreased number of osteoclasts, suggesting the alternative NF-kB pathway as a potential drug target for the amelioration of bone disease. In the present study, wild-type (WT) and aly/aly mice were subjected to silk ligation to establish a periodontitis model. Alveolar bone resorption was suppressed in aly/aly mice by decreased numbers of osteoclasts in the alveolar bone in comparison to WT mice. Furthermore, the expression of receptor activator of NF-kB ligand (RANKL) and TNFa (cytokines involved in osteoclast induction in periligative gingival tissue) was decreased. When primary osteoblasts (POBs) and bone marrow cells (BMCs) derived from WT and aly/aly mice were prepared and co-cultured, osteoclasts were induced from WT-derived BMCs, regardless of the origin of the POBs, but hardly formed from aly/aly mouse-derived BMCs. Furthermore, the local administration of an NIK inhibitor, Cpd33, inhibited osteoclast formation and thereby inhibited alveolar bone resorption in the periodontitis model. Therefore, the NIK-mediated NF-kB alternative pathway can be a therapeutic target for periodontal disease.

DOI： 10.3389/fimmu.2023.1179007

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リポジトリ公開URL： https://hdl.handle.net/2324/7172190

記述言語：英語   掲載種別：研究論文（学術雑誌）  

Amelogenesis consists of secretory, transition, maturation, and post-maturation stages, and the morphological changes of ameloblasts at each stage are closely related to their function. p130 Crk-associated substrate (Cas) is a scaffold protein that modulates essential cellular processes, including cell adhesion, cytoskeletal changes, and polarization. The expression of p130Cas was observed from the secretory stage to the maturation stage in ameloblasts. Epithelial cell-specific p130Cas-deficient (p130CasΔepi-) mice exhibited enamel hypomineralization with chalk-like white mandibular incisors in young mice and attrition in aged mouse molars. A micro-computed tomography analysis and Vickers micro-hardness testing showed thinner enamel, lower enamel mineral density and hardness in p130CasΔepi- mice in comparison to p130Casflox/flox mice. Scanning electron microscopy, and an energy dispersive X-ray spectroscopy analysis indicated the disturbance of the enamel rod structure and lower Ca and P contents in p130CasΔepi- mice, respectively. The disorganized arrangement of ameloblasts, especially in the maturation stage, was observed in p130CasΔepi- mice. Furthermore, expression levels of enamel matrix proteins, such as amelogenin and ameloblastin in the secretory stage, and functional markers, such as alkaline phosphatase and iron accumulation, and Na+/Ca2++K+-exchanger in the maturation stage were reduced in p130CasΔepi- mice. These findings suggest that p130Cas plays important roles in amelogenesis (197 words).

DOI： 10.1016/j.bone.2021.116210

記述言語：日本語   掲載種別：研究論文（学術雑誌）  

Objectives: Volume-regulated anion channels (VRACs), expressed in various cells, play an important role in cell volume regulation. Despite being physiologically defined almost half a century ago, only the molecular candi- dates of VRAC, TMEM16A, LRRC8A, and bestrophin-1 (BEST1), are known. Here, we aimed to explore the functional significance of VRAC in, HST-1, an oral squamous cell carcinoma (OSCC) cell line.
Methods: Cell proliferation assays, RT-PCR, Western blot, and flow cytometry were used to estimate changes in gene expression and cell proliferation. Ion channel activity was recorded using the patch-clamp technique. Specific genes were knocked-down by siRNA assays.
Results: VRAC, identified as a hypotonicity-induced current, was highly functional and associated with the proliferation of HST-1 cells but not of HaCaT (a normal keratinocyte) cells. The pharmacological profile of VRAC in HST-1 was similar to that reported previously. DCPIB, a specific VRAC inhibitor, completely inhibited VRAC and proliferation of HST-1 cells, eventually leading to apoptosis. VRAC in HST-1 was attenuated by the knockdown of TMEM16A and LRRC8A, while knockdown of BEST1 affected cell proliferation. In situ proximity ligation assay showed that TMEM16A and LRRC8A co-localized under isotonic conditions (300 mOsM) but were separated under hypotonic conditions (250 mOsM) on the plasma membrane.
Conclusions: We have found that VRAC acts to regulate the proliferation of human metastatic OSCC cells and the composition of VRAC may involve in the interactions between TMEM16A and LRRC8A in HST-1 cells.

DOI： 10.1016/j.ejphar.2021.173881

記述言語：英語   掲載種別：研究論文（学術雑誌）  

Musculoskeletal diseases and disorders, including osteoporosis and rheumatoid arthritis are diseases that threaten a healthy life expectancy, and in order to extend the healthy life expectancy of elderly people, it is important to prevent bone and joint diseases and disorders. We previously reported that alymphoplasia (aly/aly) mice, which have a loss-of-function mutation in the Nik gene involved in the processing of p100 to p52 in the alternative NF-κB pathway, show mild osteopetrosis with a decrease in the osteoclast number, suggesting that the alternative NF-κB pathway is a potential drug target for ameliorating bone diseases. Recently, the novel NF-κB-inducing kinase (NIK)-specific inhibitor compound 33 (Cpd33) was developed, and we examined its effect on osteoclastic bone resorption in vitro and in vivo. Cpd33 inhibited the receptor activator of NF-κB ligand (RANKL)-induced osteoclastogenesis accompanied by a decrease in the expression of nfatc1, dc-stamp, and cathepsin K, markers of osteoclast differentiation, without affecting the cell viability, in a dose-dependent manner. Cdp33 specifically suppressed the RANKL-induced processing of p100 to p52 but not the phosphorylation of p65 or the degradation or resynthesis of IκBα in osteoclast precursors. Cpd33 also suppressed the bone-resorbing activity in mature osteoclasts. Furthermore, Cdp33 treatment prevented bone loss by suppressing the osteoclast formation without affecting the osteoblastic bone formation in ovariectomized mice. Taken together, NIK inhibitors may be a new option for patients with a reduced response to conventional pharmacotherapy or who have serious side effects.

DOI： 10.1038/s41374-020-00486-1

記述言語：日本語   掲載種別：研究論文（学術雑誌）  

The G protein–coupled receptor GPRC6A regulates various physiological processes in response to its interaction with multiple ligands, such as extracellular basic amino acids, divalent cations, testosterone, and the uncarboxylated form of osteocalcin (GluOC). Global ablation of GPRC6A increases the susceptibility of mice to diet-induced obesity and related metabolic disorders. However, given that GPRC6A is expressed in many tissues and responds to a variety of hormonal and nutritional signals, the cellular and molecular mechanisms underlying the development of metabolic disorders in con- ventional knockout mice have remained unclear. On the basis of our previous observation that long-term oral administration of GluOC markedly reduced adipocyte size and improved glucose tolerance in WT mice, we examined whether GPRC6A signaling in adipose tissue might be responsible for prevention of metabolic disorders. We thus generated adipocyte-specific GPRC6A knockout mice, and we found that these animals manifested increased adipose tissue weight, adipocyte hyper- trophy, and adipose tissue inflammation when fed a high-fat and high-sucrose diet compared with control mice. These ef- fects were associated with reduced lipolytic activity because of downregulation of lipolytic enzymes such as adipose triglyc- eride lipase and hormone-sensitive lipase in adipose tissue of the conditional knockout mice. Given that, among GPR6CA ligands tested, GluOC and ornithine increased the expression of adipose triglyceride lipase in cultured 3T3-L1 adipocytes in a manner dependent on GPRC6A, our results suggest that the constitutive activation of GPRC6A signaling in adipocytes by GluOC or ornithine plays a key role in adipose lipid handling and the prevention of obesity and related metabolic disorders.

記述言語：英語   掲載種別：研究論文（学術雑誌）  

Musculoskeletal diseases and disorders, including osteoporosis and rheumatoid arthritis are diseases that threaten a healthy life expectancy, and in order to extend the healthy life expectancy of elderly people, it is important to prevent bone and joint diseases and disorders. We previously reported that alymphoplasia (aly/aly) mice, which have a loss-of-function mutation in the Nik gene involved in the processing of p100 to p52 in the alternative NF-κB pathway, show mild osteopetrosis with a decrease in the osteoclast number, suggesting that the alternative NF-κB pathway is a potential drug target for ameliorating bone diseases. Recently, the novel NF-κB-inducing kinase (NIK)-specific inhibitor compound 33 (Cpd33) was developed, and we examined its effect on osteoclastic bone resorption in vitro and in vivo. Cpd33 inhibited the receptor activator of NF-κB ligand (RANKL)-induced osteoclastogenesis accompanied by a decrease in the expression of nfatc1, dc-stamp, and cathepsin K, markers of osteoclast differentiation, without affecting the cell viability, in a dose-dependent manner. Cdp33 specifically suppressed the RANKL-induced processing of p100 to p52 but not the phosphorylation of p65 or the degradation or resynthesis of IκBα in osteoclast precursors. Cpd33 also suppressed the bone-resorbing activity in mature osteoclasts. Furthermore, Cdp33 treatment prevented bone loss by suppressing the osteoclast formation without affecting the osteoblastic bone formation in ovariectomized mice. Taken together, NIK inhibitors may be a new option for patients with a reduced response to conventional pharmacotherapy or who have serious side effects.

DOI： 10.1016/j.bone.2020.115316

記述言語：英語   掲載種別：研究論文（学術雑誌）  

Podosome formation in osteoclasts is an important initial step in osteoclastic bone resorption. Mice lacking c-Src (c-Src^−/−) exhibited osteopetrosis due to a lack of podosome formation in osteoclasts. We previously identified p130Cas (Crk-associated substrate [Cas]) as one of c-Src downstream molecule and osteoclast-specific p130Cas-deficient (p130Cas^ΔOCL−/−) mice also exhibited a similar phenotype to c-Src^−/− mice, indicating that the c-Src/p130Cas plays an important role for bone resorption by osteoclasts. In this study, we performed a cDNA microarray and compared the gene profiles of osteoclasts from c-Src^−/− or p130Cas^ΔOCL−/− mice with wild-type (WT) osteoclasts to identify downstream molecules of c-Src/p130Cas involved in bone resorption. Among several genes that were commonly downregulated in both c-Src^−/− and p130Cas^ΔOCL−/− osteoclasts, we identified kinesin family protein 1c (Kif1c), which regulates the cytoskeletal organization. Reduced Kif1c expression was observed in both c-Src^−/− and p130Cas^ΔOCL−/− osteoclasts compared with WT osteoclasts. Kif1c exhibited a broad tissue distribution, including osteoclasts. Knockdown of Kif1c expression using shRNAs in WT osteoclasts suppressed actin ring formation. Kif1c overexpression restored bone resorption subsequent to actin ring formation in p130Cas^ΔOCL−/− osteoclasts but not c-Src^−/− osteoclasts, suggesting that Kif1c regulates osteoclastic bone resorption in the downstream of p130Cas (191 words). Significance of the study: We previously showed that the c-Src/p130Cas (Cas) plays an important role for bone resorption by osteoclasts. In this study, we identified kinesin family protein 1c (Kif1c), which regulates the cytoskeletal organization, as a downstream molecule of c-Src/p130Cas axis, using cDNA microarray. Knockdown of Kif1c expression using shRNAs in wild-type osteoclasts suppressed actin ring formation. Kif1c overexpression restored bone resorption subsequent to actin ring formation in osteoclast-specific p130Cas-deficient (p130Cas^ΔOCL−/−) osteoclasts but not c-Src^−/− osteoclasts, suggesting that Kif1c regulates osteoclastic bone resorption in the downstream of p130Cas.

DOI： 10.1002/cbf.3476

記述言語：英語   掲載種別：研究論文（学術雑誌）  

Skeletal tissue homeostasis is maintained via the balance of osteoclastic bone resorption and osteoblastic bone formation. Autophagy and apoptosis are essential for the maintenance of homeostasis and normal development in cells and tissues. We found that Bax-interacting factor 1 (Bif-1/Endophillin B1/SH3GLB1), involving in autophagy and apoptosis, was upregulated during osteoclastogenesis. Furthermore, mature osteoclasts expressed Bif-1 in the cytosol, particularly the perinuclear regions and podosome, suggesting that Bif-1 regulates osteoclastic bone resorption. Bif-1-deficient (Bif-1 ^−/−) mice showed increased trabecular bone volume and trabecular number. Histological analyses indicated that the osteoclast numbers increased in Bif-1 ^−/− mice. Consistent with the in vivo results, osteoclastogenesis induced by receptor activator of nuclear factor-κB (NF-κB) ligand (RANKL) was accelerated in Bif-1 ^−/− mice without affecting RANKL-induced activation of RANK downstream signals, such as NF-κB and mitogen-activated protein kinases (MAPKs), CD115/RANK expression in osteoclast precursors, osteoclastic bone-resorbing activity and the survival rate. Unexpectedly, both the bone formation rate and osteoblast surface substantially increased in Bif-1 ^−/− mice. Treatment with β-glycerophosphate (β-GP) and ascorbic acid (A.A) enhanced osteoblastic differentiation and mineralization in Bif-1 ^−/− mice. Finally, bone marrow cells from Bif-1 ^−/− mice showed a significantly higher colony-forming efficacy by the treatment with or without β-GP and A.A than cells from wild-type (WT) mice, suggesting that cells from Bif-1 ^−/− mice had higher clonogenicity and self-renewal activity than those from WT mice. In summary, Bif-1 might regulate bone homeostasis by controlling the differentiation and function of both osteoclasts and osteoblasts (235 words).

DOI： 10.1002/jcb.29193

記述言語：英語   掲載種別：研究論文（学術雑誌）  

Endochondral ossification is important for skeletal development. Recent findings indicate that the p65 (RelA) subunit, a main subunit of the classical nuclear factor-κB (NF-κB) pathway, plays essential roles in chondrocyte differentiation. Although several groups have reported that the alternative NF-κB pathway also regulates bone homeostasis, the role of the alternative NF-κB pathway in chondrocyte development is still unclear. Here, we analyzed the in vivo function of the alternative pathway on endochondral ossification using p100-deficient (p100 ^−/− ) mice, which carry a homozygous deletion of the COOH-terminal ankyrin repeats of p100 but still express functional p52 protein. The alternative pathway was activated during the periarticular stage in wild-type mice. p100 ^−/− mice exhibited dwarfism, and histological analysis of the growth plate revealed abnormal arrangement of chondrocyte columns and a narrowed hypertrophic zone. Consistent with these observations, the expression of hypertrophic chondrocyte markers, type X collagen (ColX) or matrix metalloproteinase 13, but not early chondrogenic markers, such as Col II or aggrecan, was suppressed in p100 ^−/− mice. An in vivo BrdU tracing assay clearly demonstrated less proliferative activity in chondrocytes in p100 ^−/− mice. These defects were partly rescued when the RelB gene was deleted in p100 ^−/− mice. Taken together, the alternative NF-κB pathway may regulate chondrocyte proliferation and differentiation to maintain endochondral ossification.

DOI： 10.1016/j.bone.2019.01.002

記述言語：英語   掲載種別：研究論文（学術雑誌）  

The uncarboxylated form of osteocalcin (GluOC) regulates glucose and lipid metabolism in mice. We previously showed that low-dose (≤10 ng/ml) GluOC induces the expression of adiponectin and peroxisome proliferator- activated receptor γ (PPARγ) via a cAMP–PKA–ERK–CREB signaling pathway in 3T3-L1 adipocytes. We also noticed that high-dose (≥20 ng/ml) GluOC inhibits the expression of adiponectin and PPARγ in these cells. We have here explored the mechanism underlying these effects of high-dose GluOC. High-dose GluOC triggered morphological changes in 3T3-L1 adipocytes suggestive of the induction of cell death. It activated the putative GluOC receptor GPRC6A and thereby induced the production of cAMP and activation of protein kinase A (PKA), similar to signaling by low-dose GluOC with the exception that the catalytic subunit of PKA also entered the nucleus. Cytosolic PKA induced phosphorylation of cAMP response element-binding protein (CREB) at serine-133 via extracellular signal-regulated kinase (ERK). Nuclear PKA appeared to mediate the inhibitory phosphorylation of salt-inducible kinase 2 (SIK2) at serine- 358 and thereby to alleviate the inhibitory phosphorylation of the CREB co-activator p300 at serine-89. The activation of CREB and p300 resulted in increased expression of the transcription factor FoxO1 and consequent upregulation of Fas ligand (FasL) at the plasma membrane. The interaction of FasL with Fas on neighboring adipocytes triggered the phosphorylation at threonine-357/serine-358 and homotrimerization of mixed-lineage kinase domain-like protein (MLKL), a key regulator of necroptosis, as well as Ca2+ influx via transient receptor potential melastatin 7 (TRPM7), the generation of reactive oxygen species and lipid peroxides, and dephosphorylation of dynamin-related protein 1 (DRP1) at serine-637, resulting in mitochondrial fragmentation. Together, our results indicate that high-dose GluOC triggers necroptosis through upregulation of FasL at the plasma membrane in a manner dependent of activation of CREB-p300, followed by the activation of Fas signaling in neighboring adipocytes.

DOI： 10.1038/s41419-018-1257-7

記述言語：英語   掲載種別：研究論文（学術雑誌）  

Bone morphogenetic protein (BMP) potentiates bone formation through the Smad signaling pathway in vitro and in vivo. The transcription factor nuclear factor κB (NF- κB) suppresses BMP-induced osteoblast differentiation. Recently, we identified that the transactivation (TA) 2 domain of p65, a main subunit of NF-κB, interacts with the mad homology (MH) 1 domain of Smad4 to inhibit BMP signaling. Therefore, we further attempted to identify the interacting regions of these two molecules at the amino acid level. We identified a region that we term the Smad4-binding domain (SBD), an amino-terminal region of TA2 that associates with the MH1 domain of Smad4. Cell-permeable SBD peptide blocked the association of p65 with Smad4 and enhanced BMP2-induced osteoblast differentiation and mineralization without affecting the phosphorylation of Smad1/5 or the activation of NF-κB signaling. SBD peptide enhanced the binding of the BMP2-inudced phosphorylated Smad1/5 on the promoter region of inhibitor of DNA binding 1 (Id-1) compared with control peptide. Although SBD peptide did not affect BMP2-induced chondrogenesis during ectopic bone formation, the peptide enhanced BMP2-induced ectopic bone formation in subcortical bone. Thus, the SBD peptide is useful for enabling BMP2-induced bone regeneration without inhibiting NF-κB activity.

DOI： 10.1002/jcp.26571

記述言語：英語   掲載種別：研究論文（学術雑誌）  

Phospholipase C-related but catalytically inactive protein (PRIP) was first isolated as an inositol 1,4,5-trisphosphate binding protein. We generated PRIP gene-deficient mice which exhibited the increased bone mineral density and trabecular bone volume, indicating that PRIP is implicated in the regulation of bone properties. In this study, we investigated the possible mechanisms by which PRIP plays a role in bone morphogenetic protein (BMP) signaling, by analyzing the culture of primary cells isolated from calvaria of two genotypes, the wild type and a mutant. In the mutant culture, enhanced osteoblast differentiation was observed by measuring alkaline phosphatase staining and activity. The promoter activity of Id1 gene, responding immediately to BMP, was also more increased. Smad1/5 phosphorylation in response to BMP showed an enhanced peak and was more persistent in mutant cells, but the dephosphorylation process was not different between the two genotypes. The luciferase assay using calvaria cells transfected with the Smad1 mutated as a constitutive active form showed increased transcriptional activity at similar levels between the genotypes. The expression of BMP receptors was not different between the genotypes. BMP-induced phosphorylation of Smad1/5 was robustly decreased in wild type cells, but not in mutant cells, by pretreatment with DB867, an inhibitor of methyltransferase of inhibitory Smad6. Furthermore, BMP-induced translocation of Smad6 from nucleus to cytosol was not much observed in PRIP-deficient cells. These results indicate that PRIP is implicated in BMP-induced osteoblast differentiation by the negative regulation of Smad phosphorylation, through the methylation of inhibitory Smad6.

記述言語：英語   掲載種別：研究論文（学術雑誌）  

The uncarboxylated form (ucOC), but not the γ-carboxylated form (GlaOC), of the bone-derived protein osteocalcin stimulates insulin secretion and regulates energy metabolism in insulin target tissues. Glucagon-like peptide–1 (GLP-1) is an insulin secretagogue that is released from the gut in response to food intake. We have now found that Gprc6a, a putative ucOC receptor, is expressed in epithelial cells of the mouse small intestine as well as in STC-1 enteroendocrine cells. Secretion of GLP-1 by STC-1 cells was stimulated by ucOC but not by GlaOC. The serum GLP-1 concentration in mice was increased by intraperitoneal or oral administration of ucOC, whereas GlaOC was effective in this regard only after oral application. Serum insulin levels were also increased by ucOC, and this effect was potentiated by an inhibitor of dipeptidyl peptidase IV and blocked by a GLP-1 receptor antagonist. Intravenous injection of ucOC in mice increased the serum GLP-1 concentration, and also increased the serum level of insulin. Our results suggest that ucOC acts via Gprc6a to induce GLP-1 release from the gut, and that the stimulatory effect of ucOC on insulin secretion is largely mediated by GLP-1.

DOI： 10.1371

記述言語：英語   掲載種別：研究論文（学術雑誌）  

Upon starvation, cells undergo autophagy, an intracellular bulk-degradation process, to provide the required nutrients. Here, we observed that phospholipase C-related catalytically inactive protein (PRIP) binds to microtubule-associated protein 1 light chain 3 (LC3), a mammalian autophagy-related initiator that regulates the autophagy pathway. Then, we examined the involvement of PRIP in the nutrient deple- tion-induced autophagy pathway. Enhanced colocalization of PRIP with LC3 was clearly seen in nutrient- starved mouse embryonic fibroblasts under a fluorescent microscope, and interaction of the proteins was revealed by immunoprecipitation experiments with an anti-LC3 antibody. Under starvation conditions, there were more green fluorescent protein fused-LC3 dots in mouse embryonic fibroblasts from PRIP- deficient mice than in fibroblasts from wild type cells. The formation of new dots in a single cell increased, as assessed by time-lapse microscopy. Furthermore, the increase in autophagosome formation in PRIP-deficient cells was notably inhibited by exogenously overexpressed PRIP. Taken together, PRIP is a novel LC3-binding protein that acts as a negative modulator of autophagosome formation.

DOI： 10.1016

記述言語：英語   掲載種別：研究論文（学術雑誌）  

Mechanisms linked to actin filaments have long been thought to cooperate in smooth muscle contraction, although key molecules were unclear. We show evidence that cardiac troponin T (cTnT) substantially contributes to Ca2+-mediated contraction in a physiological range of [Ca2+]i. cTnT was detected in various smooth muscles of the aorta, trachea, gut and urinary bladder, including in humans. Also, cTnT was distributed along with tropomyosin in the cytoplasm of smooth muscle cells, suggesting that these proteins are ready to cause smooth muscle contraction. In chemically permeabilised smooth muscle of cTnT+/- mice in which cTnT reduced to ~50%, the Ca2+-force relationship was shifted toward greater [Ca2+]i, indicating a sizeable contribution of cTnT to smooth muscle contraction at [Ca2+]i < 1 μM Furthermore, addition of supplemental TnI and TnC reconstructed a troponin system to enhance contraction. The results indicated that a Tn/Tn-like system on actin-filaments cooperates together with the Ca/CaM/MLCK pathway.

DOI： 10.1038/srep00979

記述言語：英語   掲載種別：研究論文（学術雑誌）  

AIMS: We investigated the relative important role of rho kinase (ROK) and protein kinase C (PKC) pathways in carbachol (CCh)-induced Ca(2+) sensitization in α-toxin permeabilized Guinea pig detrusor smooth muscle (DSM) following bladder outlet obstruction (BOO).
METHODS: Bladder outlet obstruction was created by placement of a silver jeweler's jump rings loosely round the urethro-vesical junction of Guinea pigs. Sham operated Guinea pig underwent a similar protocol without application of the ring and served as control. α-Toxin permeabilized DSM strips from control Guinea pigs and those subjected to 6-8 weeks of BOO were mounted horizontally for isometric force recording in 100 µl relaxing solution on perspex block. The effect of ROK inhibitor (Y-27632) and PKC inhibitor (GF-109203X) on CCh-induced Ca(2+) sensitization was studied during sustained contraction. Permeabilized DSM strips were also stimulated by cumulative increase of Ca(2+) concentration compared to that in control in the presence and in the absence of sensitization-induced PKC activator, phorbol 12,13-dibutyrate.
RESULTS: Ca(2+) sensitization-induced by CCh was greater in BOO compared to controls. This muscarinic agonist-induced Ca(2+) sensitization was inhibited by Y-27632 or GF-109203X. The inhibitory effect of Y-27632 (5 µM) was greater while the inhibitory effect of GF-109203X (5 µM) was smaller in BOO compared to that in controls. Phorbol 12,13-dibutyrate (1 µM) markedly increased Ca(2+) sensitivity in controls but not in BOO.
CONCLUSIONS: Our findings provide the first evidence that BOO enhances the ROK pathway and diminishes the PKC pathway in CCh-induced Ca(2+) sensitization in contraction of permeabilized Guinea pig DSM and suggest that inhibitors of ROK might potentially relieve bladder dysfunction related to BOO.

DOI： 10.1002/nau.21193

記述言語：英語   掲載種別：研究論文（学術雑誌）  

PRIP (phospholipase C-related, but catalytically inactive protein) is a novel protein isolated in this laboratory. PRIP-deficient mice showed increased serum gonadotropins, but decreased gonadal steroid hormones. This imbalance was similar to that for the cause of bone disease, such as osteoporosis. In the present study, therefore, we analyzed mutant mice with special reference to the bone condition. We first performed three-dimensional analysis of the femur of female mice. The bone mineral density and trabecular bone volume was higher in mutant mice. We further performed histomorphometrical assay of bone formation parameters: bone formation rate, mineral apposition rate, osteoid thickness and osteoblast number were up-regulated in the mutant, indicating that increased bone mass is caused by the enhancement of bone formation ability. We then performed the culture of primary cells isolated from calvaria prepared from both genotypes. In mutant mice, osteoblast differentiation, as assessed by alkaline phosphatase activity and the expression of osteoblast differentiation marker genes, was enhanced. Moreover, we analyzed the phosphorylation of Smad1/5/8 in response to bone morphogenetic protein, with a longer lasting phosphorylation in the mutant. These results indicate that PRIP is implicated in the negative regulation of bone formation.

記述言語：英語   掲載種別：研究論文（学術雑誌）  

Aims: We investigated the relative important role of rho kinase (ROK) and protein kinase C (PKC) pathways in carba- chol (CCh)-induced Ca2þ sensitization in a-toxin permeabilized Guinea pig detrusor smooth muscle (DSM) following bladder outlet obstruction (BOO). Methods: Bladder outlet obstruction was created by placement of a silver jeweler’s jump rings loosely round the urethro-vesical junction of Guinea pigs. Sham operated Guinea pig underwent a similar protocol without application of the ring and served as control. a-Toxin permeabilized DSM strips from control Guinea pigs and those subjected to 6–8 weeks of BOO were mounted horizontally for isometric force recording in 100 ml relax- ing solution on perspex block. The effect of ROK inhibitor (Y-27632) and PKC inhibitor (GF-109203X) on CCh-induced Ca2þ sensitization was studied during sustained contraction. Permeabilized DSM strips were also stimulated by cumu- lative increase of Ca2þ concentration compared to that in control in the presence and in the absence of sensitization- induced PKC activator, phorbol 12,13-dibutyrate. Results: Ca2þ sensitization-induced by CCh was greater in BOO compared to controls. This muscarinic agonist-induced Ca2þ sensitization was inhibited by Y-27632 or GF-109203X. The inhibitory effect of Y-27632 (5 mM) was greater while the inhibitory effect of GF-109203X (5 mM) was smaller in BOO compared to that in controls. Phorbol 12,13-dibutyrate (1 mM) markedly increased Ca2þ sensitivity in controls but not in BOO. Conclusions: Our findings provide the first evidence that BOO enhances the ROK pathway and diminishes the PKC pathway in CCh-induced Ca2þ sensitization in contraction of permeabilized Guinea pig DSM and suggest that inhibitors of ROK might potentially relieve bladder dysfunction related to BOO. Neurourol. Urodynam.
" 2012 Wiley Periodicals, Inc.

DOI： 10.1002/nau

記述言語：英語   掲載種別：研究論文（学術雑誌）  

We investigated the actions of UTP in rat arterial tissues (aorta, cerebral and mesenteric arteries) and single myocytes dispersed from them. Application of UTP ( 10μM) to myocytes elicited an inward-rectifying cationic current strongly reminiscent ofP2Xchannels.Similarcurrentswerealsoelicitedbyα,β-methyleneATP( 100nM) orUDP( 1mM),andtheeffectsofUTPandα,β-methyleneATPweremutually exclusive. The UTP-activated current was insensitive to G-protein modulators, TRPC3 inhibitors or intracellular application of TRPC3 antibody, but was inhibited by pretreatment with TNP-ATP, suramin, PPADS, and greatly attenuated by intracellular application of P2X1 antibody. In the outside-out patch configuration, both UTP (1mM) and α,β-methylene ATP (10μM) elicited single channel activities showing an identical unitary conductance. UTP ( 10μM) provoked a dose-dependent contraction of de-endothelialised aortic ring preparation consisting of initial phasic and subsequent tonic components. Removal of extracellular Ca2+ or bath-applied TNP-ATP (30μM) or nifedipine (10μM) completely inhibited the phasic contraction while only partially reducing the tonic one. The tonic contraction remaining in the absence of Ca2+ was almost completely abolished by simultaneous application of thapsigargin (2μM). Similar biphasic rises in [Ca2+]i were also evoked by UTP in rat aortic myocytes. Significant expression of P2X1 as well as P2Y2, 4, 6 receptors was detected in all arteries at mRNA or protein levels by RT-PCR and immunoblotting. P2X1 channel localized in arterial media and on plasma membrane of smooth muscle cells by immunohistochemistry. Collectively, these results suggest that UTP may dually regulate the arterial tone via activation of P2X1-like and P2Y receptors.

記述言語：英語   掲載種別：研究論文（学術雑誌）  

記述言語：英語   掲載種別：研究論文（学術雑誌）  

Calcitonin (CT), whose secretion from thyroid glands is regulated by increases in the concentration of extracellular Ca2+, is a well-known hormone that regulates calcium homeostasis. However, the molecular mechanisms underlying the gene expression dependent on Ca2+ have not been clarified. The downstream regulatory element (DRE) antagonist modulator (DREAM) was recently identified as a Ca2+-dependent transcriptional repressor. In the present study, we investigated the possible involvement of DREAM in the regulation of CT gene expression and secretion. A luciferase assay using TT cells, a thyroid carcinoma cell line, showed that a particular region in the CT gene promoter repressed the promoter activity under basal conditions but induced the activity when the Ca2+ concentration was increased. We found two DRE sequences in a region located upstream from the transcription start site. Gel retardation assay confirmed that DREAM bound to the CT-DRE and also indicated that DREAM bound to the DRE in a Ca2+ dependent manner. We generated stable transfectants of TT cells with wild type or mutant DREAM, which lacked the responsiveness to Ca2+ changes. In contrast to the wild type, overexpression of the mutant DREAM inhibited the increase in CT secretion induced by a calcium ionophore. The addition of forskolin to increase adenosine 3ユ,5ユ-cyclic monophosphate (cAMP) activated the CT promoter, probably by the interaction of DREAM with cAMP responsive element binding proteins, independent on the activation by Ca2+. Together, these results suggest that DREAM plays an important role in human CT gene expression in a Ca2+ and cAMP dependent manner.

記述言語：英語   掲載種別：研究論文（学術雑誌）  

The PRIP [phospholipase C (PLC) related, but catalytically inactive protein] family has been isolated as a novel inositol 1,4,5-trisphosphate binding protein with a domain organization similar to phospholipase C-d but lacking PLC activity, comprising PRIP-1 and PRIP-2. The PRIP-1 gene is expressed predominantly in the brain, while PRIP-2 exhibits a relatively ubiquitous expression in rats and mice. We also found that PRIP-1 plays an important role in type A receptor signaling for g-aminobutyric acid in the brain. In this study, we investigated PRIP-1 gene structure and the possible mechanisms involved in the expression. The tissue distribution pattern of PRIP gene expression in humans was similar as that in rodents. 5ユRACE (rapid amplification of cDNA ends) analysis using PRIP-1 gene specific primers with human brain mRNA revealed the presence of three new exons, indicating that the PRIP-1 gene is organized into 8 exons intervened by 7 introns. Although three transcripts resulting from the alternative splicing of exon 2 and/or 3 were detected, a transcript lacking exons 2 and 3 was predominantly expressed in humans, suggesting that the translation start codon of human PRIP-1 exists in exon 1. To characterize the human PRIP-1 promoter, transient luciferase assay was carried out with luciferase constructs including various lengths of the 5ユflanking region of the PRIP-1 gene. The results indicated that the positive regulatory region is located -237 to -107 bp upstream from the transcription start site. Gel shift assay revealed the specific binding of some nuclear proteins to this region, suggesting that the existence of transcription factors contributes to the positive regulation of PRIP-1 gene expression. Mutation analyses revealed that the binding of a transcription factor, MAZ to the regulatory site leads to the promoter activity, indicating that MAZ is involved in the expression regulation of the human PRIP-1 gene.

記述言語：英語   掲載種別：研究論文（学術雑誌）  

PRIP-1 was isolated as a novel inositol 1,4,5-trisphosphate [Ins(1,4,5)P3] binding protein with a domain organization similar to phospholipase C-delta1 (PLC-delta1) but lacking the enzymatic activity. Further studies revealed that the pleckstrin homology (PH) domain of PRIP-1 is the region responsible for binding Ins(1,4,5)P3. In this study we aimed to clarify the role of PRIP-1 at the physiological concentration in Ins(1,4,5)P3-mediated Ca2+ signaling, as we had previously used COS-1 cells overexpressing PRIP-1 (Takeuchi et al., 2000, Biochem J 349:357-368). For this purpose we employed PRIP-1 knock out (PRIP-1-/-) mice generated previously (Kanematsu et al., 2002, EMBO J 21:1004-1011). The increase in free Ca2+ concentration in response to purinergic receptor stimulation was lower in primary cultured cortical neurons prepared from PRIP-1-/- mice than in those from wild type mice. The relative amounts of [3H]Ins(1,4,5)P3 measured in neurons labeled with [3H]inositol was also lower in cells from PRIP-1-/- mice. In contrast, PLC activities in brain cortex samples from PRIP-1-/- mice were not different from those in the wild type mice, indicating that the hydrolysis of Ins(1,4,5)P3 is enhanced in cells from PRIP-1-/- mice. In vitro analyses revealed that type1 inositol polyphosphate 5-phosphatase physically interacted with a PH domain of PRIP-1 (PRIP-1PH) and its enzyme activity was inhibited by PRIP-1PH. However, physical interaction with these two proteins did not appear to be the reason for the inhibition of enzyme activity, indicating that binding of Ins(1,4,5)P3 to the PH domain prevented its hydrolyzation. Together, these results indicate that PRIP-1 plays an important role in regulating the Ins(1,4,5)P3-mediated Ca2+ signaling by modulating type1 inositol polyphosphate 5-phosphatase activity through binding to Ins(1,4,5)P3.

DOI： 10.1002/jcp.20136

記述言語：英語   掲載種別：研究論文（学術雑誌）  

Background: Inositol hexakisphosphate (InsP6) or phytic acid is a naturally occurring product in plant seeds and most mammalian cells. It has been extensively studied for its anti-cancer role and shown to have anti-cancer effects in a variety of models of carcinogenesis. However, the molecular mechanisms remain unclear and relatively high concentrations of InsP6 are required for its use as an anti-cancer drug. We reported previously our studies on the mechanism by which InsP6 suppresses tumor growth and our trials to reduce the effective InsP6 concentration. Here, we investigated the effectiveness of histone at lowering the concentration of InsP6 required for anti-cancer activity.
Materials and Methods: We injected nude mice with HeLa cells treated with the chemicals of interest and measured the size of the tumors generated. The viability of tumor cells treated with InsP6 plus/minus histone and the dephosphorylation of the InsP6 internalized were also investigated.
Results: It was observed that co-administration of histone was effective at lowering the concentration of InsP6 required to induce the apoptosis of HeLa cells. The concentration of InsP6 required to suppress the growth of tumor cells transplanted was also reduced by co-administration with histone. Internalization of extracellular InsP6 and its subsequent dephosphorylation in tumor cells was also increased by histone.
Conclusion: Our results suggest that histone is effective at reducing the concentration of InsP6 required to induce the apoptosis of tumor cells.

記述言語：英語   掲載種別：研究論文（学術雑誌）  

The hydrolysis of phosphatidylinositol(4,5)-bisphosphate [PtdIns(4,5)P2] by phosphoinositide-specific phospholipase C (PI-PLC) (EC 3.1.4.10) occurs in response to a large number of extracellular signals. Four families of mammalian PI-PLC, PLCβ (β1ミβ4), PLCγ (γ1ミγ2), PLCδ (δ1ミδ4) and PLC have been described. Each family is characterized by the distinct domain organization and type of signaling pathways that regulate enzyme activity. Components of different signaling pathways, resulting in activation of specific PI-PLC isoforms, have been well characterized, in particular for the members of PLCβ and PLCγ families. In comparison, less is known about structural and mechanistic aspects of PI-PLC activation. Structural insights are only available for PLCδ1 that proved very informative regarding the conserved PI-PLC core and the catalytic mechanism, shared by all families. However, there is no direct structural study addressing changes that accompany transition from an inactive to an active PI-PLC and the related experimental evidence has been obtained by combination of other experimental approaches. The picture is most complete for PLCγ isoforms that will be the focus of this review. Components of PLCγ signaling pathways in different cellular contexts, including a suggested role in cancer, will be described first and followed by the analysis of possible models for mechanism of activation of PLCγ isoforms. Finally, current insights into the mechanism of inhibition of the enzyme activity and prospects for identification of novel inhibitors will be discussed.

記述言語：英語   掲載種別：研究論文（学術雑誌）  

Studies of PLCg (phospholipase Cg) have identified a number of regulatory components required for signalling; however, molecular mechanisms and the relationship between events leading to translocation and an increase of substrate hydrolysis have not been well defined. The addition of a membrane-targeting tag to many signal transducers results in constitutive activation, suggesting that these processes could be closely linked and difficult to dissect. The present study of PLCg2 regulation by cross-linking of the BCR (B-cell antigen receptor) or H2O2 stress in DT40 B-cells, demonstrated that the membrane targeting is a separate step from further changes that result in enzyme activation and substrate hydrolysis. Furthermore, we have defined the roles of different domains of PLCg2 and, using a panel of cell lines deficient in components linked to PLCg2 regulation, the involvement of signalling molecules with respect to each of the steps. We have found that only the lipid-raft-targeted Lyn-PLCg2 construct, unlike non-specific membrane targeting, overcame the requirement for the adapter protein BLNK (B-cell linker). The stable expression of Lyn-PLCg2 was not accompanied by an increase in substrate hydrolysis in resting cells, which followed stimulation and specifically required the presence and/or activation of Syk, Btk, phosphoinositide 3-kinase but not BLNK, as established using deficient cell lines or specific inhibitors. Based on mutational analysis of the specific tyrosine residues [Tyr753Phe (Y753F)/Y759F] and SH2 (Src homology 2) domains (R564A/R672A) in the context of Lyn-PLCg2, we found that Tyr753/Tyr759 were essential, whereas the PLCg2 SH2 domains did not have an important role in the transient activation of Lyn-PLCg2 but may serve to stabilize an activated form in sustained activation.

記述言語：英語   掲載種別：研究論文（学術雑誌）  

The protein p130 was isolated from rat brain as an inositol 1,4,5-trisphosphate-binding protein with a domain organization similar to that of phospholipase C-delta1 but lacking PLC activity. We show that p130 plays an important role in signaling by the type A receptor for gamma-aminobutyric acid (GABA). Yeast twohybrid screening identified GABARAP (GABAA receptor-associated protein), which is proposed to contribute to the sorting, targeting or clustering of GABAA receptors, as a protein that interacts with p130. Furthermore, p130 competitively inhibited the binding of the gamma2 subunit of the GABAA receptor to GABARAP in vitro. Electrophysiological analysis revealed that the modulation of GABA-induced Cl- current by Zn2+ or diazepam, both of which act at GABAA receptors containing gamma subunits, is impaired in hippocampal neurons of p130 knockout mice. Moreover, behavioral analysis revealed that motor coordination was impaired and the intraperitoneal injection of diazepam induced markedly reduced sedative and antianxiety effects in the mutant mice. These results indicate that p130 is essential for the function of GABAA receptors, especially in response to the agents acting on a gamma2 subunit.

記述言語：英語   掲載種別：研究論文（学術雑誌）  

A family of phospholipase C-related, catalytically inactive proteins (designated PRIP) have been identified as a group of novel inositol 1,4,5-trisphosphate binding proteins with a domain organization similar to phospholipase C- but lacking the enzymatic activity. The PRIP family consists of at least two types of proteins (PRIP-1 and PRIP-2 subfamilies). In the present study, we examined the tissue distribution of PRIP-2, its expression in rat brain at the mRNA level, and the characteristics of its binding to inositol compounds, protein phosphatase 1, and -amino butyric acid receptor associated protein. We also compared these characteristics with those of PRIP-1. Northern blot analysis and reverse-transcription polymerase chain reaction showed that PRIP-1 was present mainly in the brain, whereas PRIP-2 was expressed ubiquitously. In situ hybridization studies using rat brain revealed that the mRNA for both PRIP-1 and PRIP-2 was similarly expressed; it was detected in the granular cell and Purkinje cell layers in the cerebellum, and in the hippocampal pyramidal cells, dentate granule cells, and pyramidal and/or granule cells of the cerebral cortex in the cerebrum. PRIP-2 bound inositol 1,4,5-trisphosphate and its parent lipid, phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate, with a similar affinity, while PRIP-1 preferentially bound the former ligand by about 10-fold. PRIP-1 and PRIP-2 interacted with protein phosphatase 1 and gamma-amino butyric acid receptor associated protein in a similar manner. These results indicate that, similar to PRIP-1, PRIP-2 may be involved in both inositol 1,4,5-trisphosphate-mediated and -amino butyric acid-related signaling.

DOI： 10.1016/S0024-3205(02)02275-0

記述言語：英語   掲載種別：研究論文（学術雑誌）  

It has been reported that inositol hexakisphosphate (InsP6, phytic acid), a natural product, has an anticancer role. However, there is inadequate information regarding the mechanism by which InsP6 exerts anticancer actions, and the effect requires relatively high concentration of the agent, both of which hinders the usage of InsP6 as an anticancer drug. In the present study, we investigated the mechanism by which InsP6 acts as an anticancer agent, and tried to reduce the concentration of effective InsP6. Treatment of HeLa cells with InsP6 at 1 mM induced apoptosis, as assessed by counting the cell number, and by Hoechst and TUNEL staining. This is probably mediated by intracellular InsP6 itself and/or the dephosphorylated forms of metabolized InsP6, because incubation of HeLa cells with [3H]InsP6 produces dephosphorylated forms such as InsP4 and InsP5. Induction of apoptosis by InsP6 was examined in two ways: inhibition of cell survival signaling and direct induction of apoptosis. Treatment of HeLa cells with tumor necrosis factor (TNF) or insulin stimulated the Akt-nuclear factor B (NFkB) pathway, a cell survival signal, which involves the phosphorylation of Akt and IkB, nuclear translocation of NFkB and NFkB-luciferase transcription activity. InsP6 blocked all these cellular events, but phosphatidylinositol 3-kinase activity was not affected. As well as inhibiting the Akt-NFkB pathway, InsP6 itself caused mitochondrial permeabilization, followed by cytochrome c release, which later caused activation of the apoptotic machinery, caspase 9, caspase 3 and poly (ADP-ribose) polymerase. When InsP6 was applied together with histone, the effective concentration to induce apoptosis was ~10-fold lower. These results revealed that extracellularly applied InsP6 directly activates the apoptotic machinery as well as inhibits the cell survival signaling, probably by the intracellular delivery followed by a dephosphorylation.

DOI： 10.1093/carcin/23.12.2031

記述言語：英語   掲載種別：研究論文（学術雑誌）  

The translocation of fluorescently tagged PLC-gamma and requirements for this process in cells stimulated with EGF were analyzed using real time fluorescence microscopy applied for the first time to monitor growth factor receptor-effector interactions. The translocation of PLC-gamma to the plasma membrane required the functional Src homology 2 domains and was not affected by mutations in the pleckstrin homology domain or inhibition of phosphatidylinositol (PI) 3-kinase. An array of domains specific for PLC-gamma isoforms was sufficient for this translocation. The dynamics of translocation to the plasma membrane and redistribution of PLC-gamma, relative to localization of the EGF receptor and PI 4,5-biphosphate (PI 4,5-P2), were shown. Colocalization with the receptor was observed in the plasma membrane and in membrane ruffles where PI 4,5-P2 substrate could also be visualized. At later times, internalization of PLC, which could lead to separation from the substrate, was observed. The data support a direct binding of PLC-gamma to the receptor as the main site of the plasma membrane recruitment. The presence of PLC-gamma in membrane structures and its access to the substrate appear to be transient and are followed by a rapid incorporation into intracellular vesicles, leading to downregulation of the PLC-gamma activity.

記述言語：英語   掲載種別：研究論文（学術雑誌）  

Phospholipase C (PLC) gamma isoforms are regulated through activation of tyrosine kinase-linked receptors. The importance of growth factor-stimulated phosphorylation of specific tyrosine residues has been documented for PLC-gamma1; however, despite the critical importance of PLC-gamma2 in B-cell signal transduction, neither the tyrosine kinase(s) that directly phosphorylate PLC-gamma2 nor the sites in PLC-gamma2 that become phosphorylated after stimulation are known. By measuring the ability of human PLC-gamma2 to restore calcium responses to the B-cell receptor stimulation or oxidative stress in a B-cell line (DT40) deficient in PLC-gamma2, we have demonstrated that two tyrosine residues, Tyr753 and Tyr759, were important for the PLC-gamma2 signaling function. Furthermore, the double mutation Y753F/Y759F in PLC-gamma2 resulted in a loss of tyrosine phosphorylation in stimulated DT40 cells. Of the two kinases that previously have been proposed to phosphorylate PLC-gamma2, Btk, and Syk, purified Btk had much greater ability to phosphorylate recombinant PLC-gamma2 in vitro, whereas Syk efficiently phosphorylated adapter protein BLNK. Using purified proteins to analyze the formation of complexes, we suggest that function of Syk is to phosphorylate BLNK, providing binding sites for PLC-gamma2. Further analysis of PLC-gamma2 tyrosine residues phosphorylated by Btk and several kinases from the Src family has suggested multiple sites of phosphorylation and, in the context of a peptide incorporating residues Tyr753 and Tyr759, shown preferential phosphorylation of Tyr753.

記述言語：英語   掲載種別：研究論文（学術雑誌）  

A soluble phospholipase C (PLC) from boar sperm generates InsP3 and hence causes Ca2+ release when added to sea urchin egg homogenate. This PLC activity is associated with the ability of sperm extracts to cause Ca2+ oscillations in mammalian eggs following fractionation. A sperm PLC may, therefore, be responsible for causing the observed Ca2+ oscillations at fertilization. In the present study we have further characterized this boar sperm PLC activity using sea urchin egg homogenate. Consistent with a sperm PLC acting on egg PtdIns(4,5)P2, the ability of sperm extracts to release Ca2+ was blocked by preincubation with the PLC inhibitor U73122 or by the addition of neomycin to the homogenate. The Ca2+-releasing activity was also detectable in sperm from other species and in whole testis extracts. However, activity was not observed in extracts from other tissues. Moreover recombinant PLCb1, -g1, -g2, -d1, all of which had higher specific activities than boar sperm extracts, were not able to release Ca2+ in the sea urchin egg homogenate. In addition these PLCs were not able to cause Ca2+ oscillations following microinjection into mouse eggs. These results imply that the sperm PLC possesses distinct properties that allow it to hydrolyse PtdIns(4,5)P2 in eggs.

記述言語：英語   掲載種別：研究論文（学術雑誌）  

We have derived the full-length sequences of the human and rat forms of the multiple inositol polyphosphate phosphatase (MIPP); their structural and functional comparison with a chick histidine acid phosphatase (HiPER1) has revealed new information: (1) MIPP is approximately 50% identical to HiPER1, but the ER-targeting domains are divergent; (2) MIPP appears to share the catalytic requirement of histidine acid phosphatases, namely, a C-terminal His residue remote from the RHGxRxP catalytic motif; (3) rat MIPP mRNA is up-regulated during chondrocyte hypertrophy. The latter observation provides a context for proposing that MIPP may aid bone mineralization and salvage the inositol moiety prior to apoptosis.

DOI： 10.1016/S0014-5793(98)01636-6

記述言語：英語   掲載種別：研究論文（学術雑誌）  

We have isolated a novel inositol 1,4,5-trisphosphate binding protein with molecular mass of 130 kDa (p130), homologous to phospholipase C-delta1 in amino acid sequence but with no catalytic activity. Here we report the expression and localization of p130 at the mRNA level in rat brain. Northern blotting showed that gene expression encoding p130 was most abundant in brain. Brain localization of p130-mRNA using an in situ hybridization technique revealed that in the cerebellum, the mRNA was detected in the granular cell and Purkinje cell layers, and cerebellar nuclei. In the cerebrum, the mRNA was localized in hippocampal pyramidal cells, dentate granule cells and pyramidal and/or granule cells of the cerebral cortex. The brain localization of p130-mRNA was similar to that of the beta-subtype of phospholipase C, indicating that p130 may be mainly involved in phospholipase C-beta mediated signaling.

DOI： 10.1016/S0304-3940(98)00810-6

掲載種別：研究論文（学術雑誌）  

We examined whether a phosphotyrosine binding (PTB) domain from the human insulin receptor substrate-1 (hIRS-1) is capable of binding inositol phosphates/phosphoinositides. The binding specificity was compared with that of the pleckstrin homology (PH) domain derived from the same protein because the three dimensional structure was found to be very similar to that of the PH domain, despite the lack of sequence similarity. We also attempted to locate the site of binding of the inositol compounds. The PTB domain bound [3H]Ins(1,4,5)P3, which was displaced most strongly by Ins(1,3,4,5,6)P5 and InsP6, indicating that these inositol polyphosphates show the highest affinity. The PTB domain bound to liposomes containing PtdIns(4,5)P2, PtdIns(3,4,5)P3 and PtdIns(3,4)P2, but not phosphatidylinositol. In contrast, the PH domain showed a preference for Ins(1,4,5)P3, the polar head of PtdIns(4,5)P2. Site-directed mutagenesis studies were performed to map the binding site for inositol phosphates in the PTB domain. Mutation of K169Q, K171Q or K177Q, located in the loop connecting the b1 and b2 strands, which is partially responsible for binding inositol phosphates/phosphoinositides in the PH domains of several other proteins, reduced binding activity, probably because of a reduction in affinity. Mutation of R212Q or R227Q, shown to be involved in the binding of a phosphotyrosine, had little effect on the binding capacity. These results indicate that the PTB domain of hIRS-1 can bind inositol phosphates/phosphoinositides. Therefore signalling through the PTB domain could be regulated by the binding not only of proteins with phosphotyrosine but also of inositol phosphates/phosphoinositides, implying that PTB domains could be involved in a myriad of interconnections between intracellular signalling pathways.

開催年月日： 2016年12月

記述言語：英語   会議種別：シンポジウム・ワークショップ パネル（公募）  

開催地：San Francisco, CA   国名：アメリカ合衆国  

Phospholipase C-related but catalytically inactive protein (PRIP) was first identified as an inositol 1,4,5-trisphosphate binding protein. We generated PRIP gene-deficient (PRIP-KO) mice and reported that PRIP-KO mice exhibited the upregulation of the bone mineral density and trabecular bone volume, due to the enhancement of bone formation while decreased bone resorption. In this study, we investigated the possible mechanisms by which PRIP regulates bone resorption. Orthodontic tooth movement was performed using wild type (WT) and PRIP-KO mice equipped with orthodontic devices and analyzed by micro-computed tomography and TRAP staining. In the mutant mice, tooth movement was reduced compared with wild type (WT) mice, and osteoclasts were observed at the lesser amount on pressure side in KO maxillary bones. In vitro osteoclast formation assay and flow cytometric analysis were also performed and revealed the decreased differentiation for osteoclast in bone marrow cells isolated from KO mice. The expression of genes implicated in osteoclast differentiation and bone resorption was decreased in KO mice. Immunoblot analysis using cultured bone marrow cells indicated the lower expression of calcineurin in KO cells, and the phosphatase activity by calcineurin was decreased in KO cells. The expression of nuclear factor of activated T cells, cytoplasmic 1 (Nfatc1), which is an essential factor for osteoclast differentiation and the activity is regulated by calcineurin, was also decreased in KO cells in the early stage of osteoclast differentiation. These results suggest that PRIP positively regulates osteoclast differentiation, especially in the early stage, probably through calcium-calcineurin-NFAT signaling.

開催年月日： 2013年3月

会議種別：口頭発表（一般）  

開催地：宮崎   国名：日本国  

PRIP (PLC-Related but catalytically Inactive Protein) は、Ins(1,4,5)P3 結合性の分子として見いだされた新規分子であり、種を越えて広く存在するタンパク質である。我々はPRIPの機能解析を目的としてPRIPノックアウト (KO) マウスを作製し、生殖に関わる表現型の異常を見いだした。総出産仔数の減少や性周期の乱れ、性腺刺激ホルモンの血中濃度の増加などが認められたので、下垂体の器官培養や培養細胞を用いた解析を行い、KOマウスでの血中ホルモン量増加が下垂体におけるホルモンの分泌異常によるものであることを明らかにした。また、排卵誘発剤投与後の排卵数を検討したところ、KOマウスで激減していた。これは、出産仔数の減少が、排卵後の授精や着床、発育における異常によるものではなく、卵成熟を含む排卵に至る過程における異常によることを示唆した。そこで、その過程について組織形態学的及び生化学的解析を行い、排卵時ではなく卵胞成熟過程において特に2次卵胞以降への成熟が進行しにくくなっていることを見いだした。正常では成熟卵胞でのみ観察される黄体形成ホルモン受容体（LHR）が、KOマウスでは未成熟時期から発現しており、そのため下流へのシグナルが亢進し、適切な卵胞成熟が妨げられていることが示唆された。これらのことから、PRIPは生殖機構においてホルモンによる性周期、卵胞成熟の制御を適切に調節する分子であると考えられる。ヒトの卵胞成熟障害等においても類似の現象が伴うケースがあり、生殖関連疾患の有力なターゲットとなりうることが期待される。また、生殖に関わるホルモンのアンバランスから骨への影響を検討したところ、予想に反して骨量の増加が認められた。これまでの結果から骨形成の亢進と骨吸収の低下によるものと考えられるが、その分子メカニズムについて現在解析を進めている。

開催年月日： 2012年9月

記述言語：英語   会議種別：シンポジウム・ワークショップ パネル（公募）  

開催地：Sevilla   国名：スペイン  

PRIP (PLC-Related, but catalytically Inactive Protein) は、Ins(1,4,5)P3 結合性の分子として見いだされた新規分子であり、種を越えて広く存在するタンパク質である。２つのサブタイプが存在し、PRIP-1は脳に多く発現しているのに対し、PRIP-2は比較的ユビキタスな発現パターンを示す。我々は、PRIP-1及びPRIP-2のダブルノックアウトマウスを作製し、本変異マウスにおいて総出産仔数の減少、血中性腺刺激ホルモン量の増加などの表現型を見いだし、性周期制御にPRIPが強く関与することを明らかにした。排卵数を調べるため、PMSG（妊馬血清性ゴナドトロピン）、HCG（人絨毛生性腺刺激ホルモン）を用いた排卵誘発を行ったところ、変異型で激減していた。このことから、出産仔数の減少は、排卵後の授精や着床における異常によるものではなく、卵成熟を含めた排卵に至るまでの過程における異常によるものであることが示唆された。そこで、まず排卵前後における遺伝子発現の変化を検討するために、卵巣RNAを用いたマイクロアレイ解析を行った。その結果、PMSG投与後48時間でHCGを投与した卵巣において、排卵前の卵胞で発現するHas2 (hyaluronan synthase 2)、Ptgs2 (cyclooxygenase 2)、PTX3 (pentraxin 3)、Tnfαip6 (TNFα-induced protein 6)などの発現量が、変異型で増加していた。また、同時期の卵巣の組織学的解析より、変異型において卵母細胞が残ったまま黄体化したような所見があり、これらのことから排卵時の制御におけるPRIPの関与が示唆された。そこで現在、野生型及び変異型マウスにおいて、排卵直前に起こる急激な変化（卵丘細胞-卵母細胞複合体のexpansionやヒアルロン酸の発現量及び局在等）について解析を進めている。

開催年月日： 2010年12月

会議種別：シンポジウム・ワークショップ パネル（公募）  

開催地：神戸   国名：日本国  

Phospholipase C-related but catalytically inactive protein (comprising PRIP-1 and -2) was first identified as a novel D-myo-inositol 1,4,5-trisphosphate [Ins(1,4,5)P3] binding protein, but the biological functions have remained elusive. We therefore generated PRIP-1 and –2 double knockout (DKO) mice to gain insight into the biological function. DKO mice apparently grew normally and became fertile; however, during animal maintenance, we noticed that mutant couples exhibited decreased litter events and litter size, indicating dysfunction of the reproductive system. Cross-mating experiments indicated that the cause appeared to be on the female side. The observation of the estrous cycle in mice by histological analysis of vaginal smears showed that the estrous days were apparently increased in DKO mice. Levels of serum LH and FSH were measured for 5-6 consecutive days, and were significantly higher in the mutant, which was also confirmed by examining the secretion of LH from the explant culture of anterior pituitary glands of wild-type and DKO mice. We also examined the ability of the ovaries in response to gonadotropins: the total number of the ovulated oocytes were significantly decreased in mutant female mice, compared to that seen with wild-type, which was also confirmed by histological analysis of the ovaries after ovulation. These results suggest that PRIP plays an important role in female reproductive system, especially in gonadotropin secretion, ovarian follicle maturation and ovulation.

開催年月日： 2010年9月 - 2010年10月

会議種別：シンポジウム・ワークショップ パネル（公募）  

開催地：メルボルン   国名：オーストラリア連邦  

Phospholipase C-related but catalytically inactive protein (comprising PRIP-1 and -2) was first identified as a novel D-myo-inositol 1,4,5-trisphosphate [Ins(1,4,5)P3] binding protein, but the biological functions have remained elusive. We therefore generated PRIP-1 and –2 double knockout (DKO) mice to gain insight into the biological function. DKO mice apparently grew normally and became fertile; however, during animal maintenance, we noticed that mutant couples exhibited decreased litter events and litter size, indicating dysfunction of the reproductive system. Cross-mating experiments indicated that the cause appeared to be on the female side. The observation of the estrous cycle in mice by histological analysis of vaginal smears showed that the estrous days were apparently increased in DKO mice. Levels of serum LH and FSH were measured for 5-6 consecutive days, and were significantly higher in the mutant, which was also confirmed by examining the secretion of LH from the explant culture of anterior pituitary glands of wild-type and DKO mice. We also examined the ability of the ovaries in response to gonadotropins: the total number of the ovulated oocytes were significantly decreased in mutant female mice, compared to that seen with wild-type, which was also confirmed by histological analysis of the ovaries after ovulation. The analysis also showed that the numbers of follicles originally were not significantly different between WT and DKO ovaries. These results suggest that PRIP plays an important role in female reproductive system, especially in gonadotropin secretion and ovarian follicle maturation.

開催年月日： 2008年6月 - 2008年7月

会議種別：シンポジウム・ワークショップ パネル（公募）  

開催地：Athens 国際会議場   国名：ギリシャ共和国  

PRIP (phospholipase C related, but catalytically inactive protein) was identified as a novel inositol 1,4,5-trisphosphate binding protein, whose domain organization is similar to that of phospholipase C-_1 but is catalytically inactive, comprizing two isoforms, PRIP-1 and PRIP-2. To get insight into the biological functions, we generated the double knockout (DKO) mice of both PRIP-1 and PRIPミ2, followed by the phenotypic analyses. DKO mice grew normally and became fertile. However DKO female exhibited the decreased litter occasion and litter size, indicating the dysfunction of female reproductive system. Then we examined the estrus cycle by cytological analysis of daily vaginal smears, resulting in the irregular cycle in DKO mice. We further noticed that the mutant mice had apparently smaller sized uterus by gross anatomical observation. Basal levels of serum leuteinizing hormone and follicle stimulating hormone were significantly higher in the mutant, the event of which was also confirmed by examining the secretion from the tissue culture of anterior pituitary glands. These results suggest that PRIP is involved in maternal reproduction, through the gonadotropine secretion.

開催年月日： 2024年11月

記述言語：日本語   会議種別：シンポジウム・ワークショップ パネル（指名）  

開催地：長崎市   国名：日本国  

閉経後女性は骨量減少と体重増加を経験する。これまでに、エストロゲン受容体シグナルと核因子κB(NF-κB) のクロストークが報告されており、エストロゲン欠乏は NF-κB 活性化を介して破骨細胞による骨吸収を促進する。 しかし、閉経後に NF-κB がいつ、どの組織で活性化されるのか、また NF-κB が閉経後の体重増加と骨量減少の 共通シグナル分子としてどのように作用するのかは不明である。そこで我々は、生体内で NF-κB 活性化を測定 できる NF-κB レポーターマウスを作出し、卵巣摘出(OVX)したところ、OVX 後の長骨の骨幹端と性腺周囲の 白色脂肪組織での発光強度が増加したが、他の組織では増加しなかった。次に、NF-κB の活性化が亢進した 534 番目のセリン残基をアラニンに置換した S534A マウスと WT マウスに OVX を行ったところ、WT マウスと比較 して、OVX 後に耐糖能の悪化を伴う体重増加が顕著であった。WT または S534A マウスの sham 群の骨密度は 変化しなかったが、S534A-OVX 群では骨形成の抑制と骨髄脂肪細胞の増加により骨密度が有意に減少した。抗 アルコール薬のジスルフィラムは、OVX 誘導性の長骨骨幹端および白色脂肪組織(WAT)における NF-κB の 活性化、ならびに体重増加および骨量減少を抑制した。以上の結果より、OVX 後の長骨骨幹端および WAT にお ける NF-κB の活性化は、OVX 後の体重増加および骨量減少を制御しており、ジスルフィラムは新たな閉経後骨 粗鬆症と体重増加の予防薬になる可能性がある。

開催年月日： 2024年6月 - 2024年7月

記述言語：英語   会議種別：口頭発表（一般）  

開催地：沖縄市   国名：日本国  

Postmenopausal women experience bone loss and weight gain. To date, crosstalk between estrogen receptor signals and nuclear factor-κB (NF-κB) has been reported, and estrogen depletion enhances bone resorption by osteoclasts via NF-κB activation. However, it is unclear when and in which tissues NF-κB is activated after menopause, and how NF-κB acts as a common signaling molecule for postmenopausal weight gain and bone loss. Therefore, we examined the role of NF-κB in bone and energy metabolism following menopause. NF-κB reporter mice, which can be used to measure NF-κB activation in vivo, were ovariectomized (OVX) and the luminescence intensity after OVX increased in the metaphyses of the long bones and perigonadal white adipose tissue, but not in the other tissues. OVX was performed on wild-type (WT) and p65 mutant knock-in (S534A) mice, whose mutation enhances the transcriptional activity of NF-κB. Weight gain with worsening glucose tolerance was significant in S534A mice after OVX compared with those of WT mice. The bone density of the sham group in WT or S534A mice did not change, whereas in the S534A-OVX group it significantly decreased due to the suppression of bone formation and increase in bone marrow adipocytes. Disulfiram, an anti-alcoholic drug, suppressed OVX- induced activation of NF-κB in the metaphyses of long bones and white adipose tissue (WAT), as well as weight gain and bone loss. Overall, the activation of NF-κB in the metaphyses of long bones and WAT after OVX reg- ulates post-OVX weight gain and bone loss.

開催年月日： 2023年10月 - 2023年11月

記述言語：日本語   会議種別：シンポジウム・ワークショップ パネル（公募）  

開催地：福岡国際会議場   国名：日本国  

サルコペニアは、加齢に伴う骨格筋の減少と筋力の低下を特徴とする疾患であり、現在有効な治療法がない。その発症メカニズムは未だ不明な点が多いが、筋衛星細胞と呼ばれる筋幹細胞の機能低下が重要な要素の一つと考えられており、筋幹細胞の分化や増殖を制御する調節因子やシグナル経路の解明が重要な課題である。以前の研究より、イノシトール1,4,5- 三リン酸結合性タンパク質であるPLC-Related but catalytically Inactive Protein (PRIP）は、骨格筋量調節において重要なタンパク質合成の主要な制御因子であるp70 S6 kinase (S6K)のリン酸化調節に関わることが見出された。本研究では、PRIPの遺伝子欠損マウス (PRIP-KO)を用いて、骨格筋形成・分化におけるPRIPの役割について解析を行った。野生型マウスに比べて、PRIP-KOマウスの骨格筋の重量は相対的に減少していた。マウスの骨格筋組織から筋幹細胞を単離し筋細胞に分化誘導したところ、野生型に比べPRIP-KOマウス由来筋幹細胞において分化した筋細胞の割合が少なく、分化した細胞が短くて細いことが観察された。また、分化した筋細胞に高発現するミオシン重鎖の発現レベルがPRIP-KO由来筋幹細胞から分化した細胞において有意に減少していた。マウス筋芽細胞株C2C12においてshRNAを用いてPRIPを安定的にノックダウンすると、筋細胞に分化しなかった。筋特異的転写抑制因子であるPax7の発現は、PRIPがノックダウンされたことにより上昇していた。以上の結果より、PRIPが筋幹細胞の分化制御に関わることが明らかとなり、PRIPはその制御を通して骨格筋の形成に関わることが示唆された。

開催年月日： 2023年10月 - 2023年11月

記述言語：日本語   会議種別：シンポジウム・ワークショップ パネル（公募）  

開催地：福岡国際会議場   国名：日本国  

PRIP ［phospholipase C (PLC) related but catalytically inactive protein］ は、Ins(1,4,5)P3 結合性分子として見いだされた、種間で高度に保存されたタンパク質分子である。PRIP1およびPRIP2の２つのサブタイプが存在し、これまでに骨代謝や脂質代謝、生殖制御などに関わることが明らかとなっている。最近、PRIP1/2 double knockout（DKO）マウスの解析過程において、腸管のパイエル板がほぼないことを見出した。また、同じく腸管リンパ組織である孤立リンパ濾胞（ILF）も減少していたが、顎下や腋窩など他のリンパ節はほぼ正常に存在していた。そこで、PRIPがパイエル板をはじめとする腸管関連リンパ組織の形成制御に関わる分子であると考え解析を始めた。まず、PRIP1とPRIP２、どちらが責任分子かについて調べたところ、PRIP1 knockout (KO)マウス腸管のパイエル板数は野生型と同程度であったが、PRIP2-KOマウスではその数が減少していた。そこで、PRIP2-KOマウスの小腸粘膜層を構成する免疫細胞についてFACS解析を行ったところ、自然リンパ球であるILC3、およびB細胞が減少していた。また、組織の免疫染色からILFの形成が部分的に障害されていることが示された。パイエル板の形成には、リンパ球系のLTi (Lymphoid Tissue inducer)と線維芽細胞系のLTo (Lymphoid Tissue inducer)の相互作用が必須である。そこで、リンパ球系統特異的なPRIP2-cKOマウスを解析したところ、PRIP2-KOマウスと同様にILC3とB細胞の減少が認められ、LTiを含むリンパ球系細胞における異常が想定された。以上より、PRIP2はパイエル板およびILFの形成に必須の分子であり、小腸におけるILC3の分化・成熟を促し、ILFへのB細胞集簇に関与する可能性が示唆された。

開催年月日： 2022年12月 - 2022年9月

記述言語：英語   会議種別：シンポジウム・ワークショップ パネル（公募）  

開催地：熊本市   国名：日本国  

PRIP ［phospholipase C (PLC) related but catalytically inactive protein］ は、ドメイン構造がPLCδ (phospholipase Cδ) に類似しているものの酵素活性を有さないIns(1,4,5)P 3 結合性の細胞質分子として見いだされた。PRIPにはPRIP1および２のサブタイプが存在し、脊椎動物で高度に保存されたタンパク質であり、破骨細胞分化や卵巣機能の制御との関連性が報告されているが、免疫系への寄与は明らかにされていない。本研究では、PRIP 1/2-double knockoutマウスにパイエル板がないことに着目し、PRIP１、PRIP２のどちらかが責任分子であるかを調べた。PRIP 1- knockout (KO)マウスの腸管のパイエル板数は野生型と同程度であったが、PRIP 2KOマウスではパイエル板数が減少していた。また、PRIP 2-KOマウスの小腸腸管粘膜層ではILC3およびB細胞数が減少しており、組織切片の免疫染色からはILFの形成が部分的に障害されていた。以上から、PRIP２がパイエル板およびILF形成に必須の分子であると考えられる。また、PRIP2がILC3分化・成熟を促し、ILFへのB細胞集簇に寄与する可能性が示唆された。

開催年月日： 2022年9月

記述言語：日本語   会議種別：シンポジウム・ワークショップ パネル（公募）  

開催地：徳島市   国名：日本国  

転写因子 NF-κB(Nuclear Factor-κB:NF-κB)は炎症反応や免疫応答に重要な遺伝子の発現を調節す る.近年，IκBα のリン酸化・分解による活性制御のほかに，NF-κB のメインサブユニットである p65 のリン酸化が転写活性の調節に重要であることが報告されているが，その生理機能は不明な 点が多い.本研究では p65 のリン酸化部位の中で特に報告の多い 536 番(マウスでは 534 番: S534)のセリン残基の生理機能を解明するために，アラニンに置換したノックイン(S534A KI)マ ウスを作製した.本マウスは，野生型(WT)マウスと比べて外見上，および主要組織の組織形態に 差異はなかった.WT および S534KI マウスから調製したマウス胎仔線維芽細胞(MEF)を TNFα で刺激し，NF-κB および MAPK 経路の活性化を検討したところ，WT MEF と比較して，S534A MEF では S534 のリン酸化が認められず，IκBα のリン酸化および MAPK 経路の主要分子の発現 量およびリン酸化に影響はなかった.一方，NF-κB の転写活性，および IL-1β 等の NF-κB 標的遺 伝子の発現量が亢進した.また各々の MEFs を用いた RNA-seq の結果から，S534A MEF では細 胞外基質の分解に関わる分子群の発現が上昇していた.次に 8-10 週齢の雄 WT および S534A KI マウス上顎右側第二大臼歯を 6-0 絹糸で結紮した歯周炎モデルマウスを用いて，7 日後に歯槽骨 の 3 次元的解析，組織学的解析および歯周組織の遺伝子発現解析を行った.S534A KI マウスで歯 槽骨の骨吸収が有意に増加し，歯周組織の IL-1β や RANKL の遺伝子発現が亢進した.また，歯 槽骨吸収部に多数の破骨細胞数が存在した.以上より，p65 の 536 番セリンのリン酸化は，炎症 反応を負に調節することが示唆された.

開催年月日： 2022年6月

記述言語：英語   会議種別：口頭発表（一般）  

開催地：Web開催 （Chengdu, China）   国名：日本国  

Nuclear factor-κB (NF-κB) is a transcription factor that regulates the expression of a wide variety of genes involved in inflammatory diseases and immune responses including periodontitis. Recently, a new transcriptional regulatory mechanism of NF-κB through the phosphorylation of serine at 536 (534 in mice; S534) of the p65 subunit in the inflammatory diseases has been reported, however, its physiological role is unknown. Therefore we examined the possibility which S534 phosphorylation of p65 may be involved in the development of periodontitis. To clarify the involvement of S534 phosphorylation of p65 in the development of periodontitis, we generated S534A knock-in (KI) mice, in which S534 of p65 was substituted with alanine. There was no significant difference in growth rate and weight gain between wild-type (WT) and S534A KI mice. We examined the role of S534A phosphorylation on the alveolar bone resorption using mouse periodontitis model. The maxillary right second molar of each mouse was ligated using 6-0 silk string for 7 days to evaluate alveolar bone resorption by micro-computed tomography scanning. Ligature-induced bone resorption was enhanced in S534A mice compared to WT mice. Expression level of interleukin-1 (IL-1), which is a target gene of NF-κB, in gingiva of S534A KI was higher than that of WT. We also prepared mouse embryonic fibroblasts (MEF) from WT and S534A KI mice and stimulated the cells with tumor necrosis factor  (TNF). TNF induced phosphorylation of S354 within 30 minutes in WT MEFs, but not in S534A MEFs. TNF-induced degradation of IκB and phosphorylation of p38 were comparable between WT and S534A MEFs. The expression level of IL-1 by the TNF stimulation was higher in S534A MEFs than in WT MEFs. Thus, we concluded that S534 phosphorylation of p65 is a new regulator of bone resorption in periodontitis.

開催年月日： 2021年12月

記述言語：日本語   会議種別：シンポジウム・ワークショップ パネル（公募）  

開催地：横浜   国名：日本国  

PRIP［phospholipase C (PLC) related but catalytically inactive protein］は、Ins(1,4,5)P3 結合性でPLCと構造が類似するもののその酵素活性を持たない分子として見いだされた。PRIP欠損（KO）マウスにおいて海綿骨の骨量増加が認められたことから、PRIP欠損の骨代謝への影響を解析した。野生型（WT）に比べKOマウスでは、骨芽細胞への分化能が高く骨形成量の増加が認められる一方、破骨細胞の形成や機能に異常が見られた。そこで、破骨細胞分化におけるPRIPの役割について解析を進めた。マウス骨髄細胞（BM）とWTマウス由来骨芽前駆細胞との共存培養において分化誘導を行ったところ、WT由来BMに比べKO由来BMで破骨細胞数が減少し、その差はBM単独の分化誘導における差より顕著であった。そこで共存培養における分化過程での遺伝子発現を網羅的に解析したところ、様々な遺伝子の発現変化が見られた中で、KOでのNeuropilin 1（Nrp1）の発現推移がWTとは異なることを見いだした。Nrp1は、骨芽細胞から分泌され破骨細胞分化を抑制するSemaphorin 3A（Sema3A）の受容体である。通常、receptor activator of NF-kB ligand（RANKL）誘導下で破骨細胞分化に伴いNrp1の発現は低下するが、KOではその発現低下が殆ど見られなかった。また、Sema3A の受容体としてNrp1とダイマーを形成するPlexin A1は破骨細胞分化を促す免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ITAM）を介するシグナルを担う分子でもあるが、KOではITAM下流に位置するPLC2のリン酸化が減少し、RANKL刺激による細胞内Ca2+濃度の上昇も不安定で少なかった。これらのことから、KOマウスではNrp1の発現持続により、骨芽細胞からのSema3Aを受容して破骨細胞分化の抑制が続き、成熟破骨細胞が形成されにくいことが示唆された。

開催年月日： 2021年10月

記述言語：英語   会議種別：口頭発表（一般）  

開催地：Web開催 （東京）   国名：日本国  

Nuclear factor-κB (NF-κB) is a transcription factor that regulates the expression of a wide variety of genes involved in inflammatory diseases and immune responses including periodontitis. Recently, a new transcriptional regulatory mechanism of NF-κB through the phosphorylation of serine at 536 (534 in mice; S534) of the p65 subunit in the inflammatory diseases has been reported, however, its physiological role is unknown. Therefore we examined the possibility which S534 phosphorylation of p65 may be involved in the development of periodontitis. To clarify the involvement of S534 phosphorylation of p65 in the development of periodontitis, we generated S534A knock-in (KI) mice, in which S534 of p65 was substituted with alanine. There was no significant difference in growth rate and weight gain between wild-type (WT) and S534A KI mice. We examined the role of S534A phosphorylation on the alveolar bone resorption using mouse periodontitis model. The maxillary right second molar of each mouse was ligated using 6-0 silk string for 7 days to evaluate alveolar bone resorption by micro-computed tomography scanning. Ligature-induced bone resorption was enhanced in S534A mice compared to WT mice. Expression level of interleukin-1 (IL-1), which is a target gene of NF-κB, in gingiva of S534A KI was higher than that of WT. We also prepared mouse embryonic fibroblasts (MEF) from WT and S534A KI mice and stimulated the cells with tumor necrosis factor  (TNF). TNF induced phosphorylation of S354 within 30 minutes in WT MEFs, but not in S534A MEFs. TNF-induced degradation of IκB and phosphorylation of p38 were comparable between WT and S534A MEFs. The expression level of IL-1 by the TNF stimulation was higher in S534A MEFs than in WT MEFs. Thus, we concluded that S534 phosphorylation of p65 is a new regulator of bone resorption in periodontitis.

開催年月日： 2020年9月 - 2020年10月

記述言語：日本語   会議種別：口頭発表（一般）  

開催地：Web開催 （鹿児島）   国名：日本国  

オステオカルシン(OC)は骨基質タンパクの 1 つであり，骨形成時などに重要な働きをすること が知られているが，その中でも非カルボキシル化 OC(GluOC)は糖・エネルギー代謝を活性化させ ることが知られるようになった.この GluOC を脂肪細胞に作用させると，脂肪細胞は小型化し，糖・ 脂質代謝活性化ホルモンであるアディポネクチンの発現が亢進することと，その発現亢進までのシ グナル伝達経路を，我々は今までの研究で明らかにした.この研究過程において，高濃度(>20 ng/ ml)の GluOC では脂肪細胞に細胞死が誘導されている可能性に気付いた. 本研究では，高濃度 GluOC による脂肪細胞へのネクロトーシス(プログラム化されたネクローシス) 誘導メカニズムについて，そのシグナル伝達経路の解明を中心に解析した.まず，高濃度 GluOC は その受容体として知られる GPRC6A に結合し，cAMP の濃度上昇に続いて，PKA および CREB を 順次活性化させるのと同時に PKA を介して CREB の転写共役因子の1つである p300 も活性化させ， FoxO1 の発現量を亢進させる.この FoxO1 によりデス因子である FasL の発現量が亢進すると共に， 細胞膜局在も亢進する.続いて，細胞膜上に発現した FasL に対して隣接する脂肪細胞の Fas 受容 体が結合する.これにより，隣接した脂肪細胞において Fas シグナルが活性化し，この隣接した脂 肪細胞にのみネクロトーシスが誘導され，全体の約3割に相当する脂肪細胞が細胞死し，残った大 多数の脂肪細胞はアディポネクチンの発現亢進により，代謝に有利な性質を獲得する.よって，我々 が今回明らかにした GluOC の濃度によるその効果の違いや GluOC シグナル伝達経路の一部は今後， 肥満や糖尿病といった生活習慣病に対する新たな薬理学的戦略となる可能性を秘めている.

開催年月日： 2020年9月 - 2020年10月

記述言語：日本語   会議種別：口頭発表（一般）  

開催地：Web開催 （鹿児島）   国名：日本国  

G タンパク質共役型受容体の1つである GPRC6A は膵β細胞をはじめ，肝臓，骨格筋，脳，脂肪 組織など全身に広く分布し，アミノ酸，細胞外 Ca2+ のほか，テストステロンやオステオカルシン (GluOC)などの多様な分子をリガンドとして認識する.GPRC6A 欠損マウスは食餌誘発性肥満とそ れに起因するインスリン抵抗性を来たしやすく，GPRC6A シグナリングのエネルギー代謝への関与 が強く示唆されている.我々はこれまでに，3T3-L1 脂肪細胞を GPRC6A のリガンドである GluOC で刺激すると GPRC6A を介して脂肪細胞への分化に中心的な役割を果たす転写因子 PPAR γの発 現が亢進し，インスリン感受性増強作用をもつアディポネクチン分泌が促進されること，野生型マ ウスに GluOC を長期にわたって経口投与すると脂肪細胞が顕著に小型化することを明らかにしてき た.今回我々は，脂肪細胞における GPRC6A シグナリングが全身の糖・脂質代謝改善における最も 重要なターゲットであると位置づけ，成熟脂肪細胞特異的 GPRC6A ノックアウトマウス(adG6AKO) を作製して解析した.adG6AKO を高脂肪高ショ糖食で飼育すると，対照群と比較して著しい脂肪 細胞の肥大とそれに伴う脂肪組織重量の増加，肝臓への脂肪の蓄積，インスリン抵抗性による耐糖 能の低下が認められた.adG6AKO の脂肪組織では，脂肪分解酵素群の転写を制御する FoxO1 とそ の下流のリパーゼ，HSL，ATGL の発現量が低下していた.3T3-L1 脂肪細胞を GPRC6A のリガン ドで刺激したところ，幾つかのリガンドの中で，GluOC とオルニチンだけが ATGL の発現を上昇さ せた.以上のことから，脂肪組織における恒常的な GPRC6A シグナルは脂肪分解を制御することで 全身の脂肪量と全身のエネルギー代謝を調整している可能性が示唆された.

開催年月日： 2019年12月

記述言語：日本語   会議種別：シンポジウム・ワークショップ パネル（公募）  

開催地：東京都   国名：日本国  

破骨細胞の骨吸収は、破骨細胞前駆細胞から破骨細胞への「分化」と分化した破骨細胞が骨を認識して吸収する 「活性化」の2つのプロセスに大別される。破骨細胞が骨吸収を行う際には、アクチンリングと呼ばれる特殊な 構造を作ることで吸収面を密閉し、波状縁を形成し、酸とタンパク質分解酵素を分泌する。 c-Src欠損マウス は、破骨細胞が存在するものの、骨吸収ができずに大理石骨病を呈する。我々はこれまでに、アクチンリングの 形成に伴ってチロシンリン酸化が亢進するタンパク質として p130Casを同定した。 p130Casは c-Src欠損マウス 由来の破骨細胞ではチロシンのリン酸化が見られないこと、さらに破骨細胞特異的 p130Cas欠損マウスは c- Src欠損マウス同様に大理石骨病を呈することから、 p130Casが c-Srcの下流分子として骨吸収に重要な役割を 担っていることを報告した。そこで我々は、骨吸収に関与する p130Casの下流分子を同定するために、 cDNAマ イクロアレイ解析を実施し、 c-Src欠損ならびに破骨細胞特異的 p130Cas欠損マウス由来破骨細胞に共通して発 現が変動している遺伝子を検索した。それらの中から、我々は、細胞骨格を調節するキネシンファミリータンパ ク質 Kif1cを選別し、骨吸収における、 Kif1cの役割について解析を行った。 Kif1cは破骨細胞、骨芽細胞をはじめ 様々な組織に広く分布していた。破骨細胞では、その分化に伴って Kif1cの発現が上昇し、成熟破骨細胞のアクチ ンリングと核周囲に局在していた。 Kif1cをノックダウンした Raw-D細胞では、多核でアクチンリングを有する 破骨細胞の数が対照群よりも少なかった。また、 p130Cas欠損マウス由来破骨細胞及び c-Src欠損マウス由来の 破骨細胞に Kif1cを過剰発現させたところ、 p130Cas欠損マウス由来破骨細胞ではアクチンリングの形成と骨吸 収の部分的な回復が見られたが、 c-Src欠損マウス由来の破骨細胞では機能回復は見られなかった。以上の結果か ら、 Kif1cが p130Casの下流に位置して、多核化と破骨細胞の骨吸収を制御していることが示唆された。

開催年月日： 2019年12月

記述言語：日本語   会議種別：シンポジウム・ワークショップ パネル（公募）  

開催地：福岡市   国名：日本国  

PRIP (phospholipase C-related, but catalytically inactive protein) は、phospholipase C様のドメイン構造を有するがその酵素活性を持たないIns(1,4,5)P3 結合性の分子である。PRIP欠損（KO）マウスでは、出産仔数の低下及びその原因が雌に起因すること、性腺刺激ホルモンの分泌異常を示したことから、生殖機構の解析を進め今回卵巣機能におけるPRIPの役割を検討した。野生型（WT）及びKO雌マウスにおいて過排卵刺激による排卵数を調べたところ、その数はKOでWTの約20%程度であった。排卵に必須のCumulus-oocyte-complex (COC)（卵丘細胞-卵子複合体）の膨潤能を検討したところ、黄体形成ホルモン（LH）サージ様の薬剤刺激によりKOでも正常なCOC複合体の膨潤が認められた。Microarray及びreal-time PCRによる解析から、排卵前後で排卵関連遺伝子群に顕著な発現量増加が見られたが、WTとKOで同様の変化を示した。これらのことから、PRIP欠損は排卵機構には影響しないことが示唆された。そこで、卵胞成熟過程について検討したところ、組織学的解析からKOの卵巣では出血を伴った嚢胞がしばしば見られ、卵胞成熟誘発後でも未成熟卵胞が多く成熟卵胞・黄体は少なかった。また、成熟卵胞の顆粒膜細胞に発現するLH受容体がKOでは未成熟卵胞でも見られ、その発現量及びLH受容体下流のシグナル分子のリン酸化が亢進していた。更に、KOで血中エストロゲン (E2) 濃度は低下していたが、卵巣内の残存E2量は多く、産生量はWTと同等であることが推測された。以上の結果から、PRIP欠損は卵巣においてLHシグナルの亢進及びE2分泌の低下を惹起して早期の卵胞成熟過程が抑制されると考えられた。また、一部多嚢胞性卵巣症候群に似た表現型を呈することから、ヒトの卵巣関連疾患の原因に関わる可能性が示唆された。

開催年月日： 2019年12月

記述言語：日本語   会議種別：シンポジウム・ワークショップ パネル（公募）  

開催地：東京都   国名：日本国  

目的】 p130Casは Srcファミリーチロシンキナーゼの基質であり、成長因子やインテグリンシグナルによって 細胞内で様々なタンパク質と複合体を形成するアダプタータンパク質である。 p130Casは歯、唾液腺、腎臓など 上皮間葉相互作用によって形成される器官に発現しており、これらの器官形成や機能発現に重要であることが示 唆される。特に歯の発生過程において、エナメル質の広範囲にその発現が認められたことから、歯の発生および 成熟過程における p130Casの生理的機能を明らかにするために、上皮特異的に p130Casを欠損させたマウス( p130Cas cKO)を作製し、歯の解析を行った。【方法と結果】野生型および p130Cas cKOマウスの切歯を観察 すると p130Cas cKOマウスの切歯は野生型と比較して白濁していた。この所見は歯を構成するイオンの濃度の違 いを示唆するので、 EPMA解析で Ca、 P、 Mgの含有量を測定したところ、野生型と比較して各元素の含有量が 低下していた。また、石灰化状態、エナメル質の強度を比較するため、 Micro CT撮影およびビッカース硬さ試験 を行った。 p130Cas cKOマウスの Micro CT写真では、野生型と比べてエナメル質の菲薄化、歯髄腔の開大が見 られ、エナメル密度も低下し、ビッカース硬さも小さかった。一方、臼歯は著明な形態変化、白濁、およびエナ メル質の菲薄化も認められなかった。また、歯原性上皮細胞株である SF2細胞の p130Casをノックダウンすると 細胞が縮小し、伸展が抑制されていることが観察された。【結論】以上の解析結果より p130Casは切歯エナメル 質の成熟過程に関与していることが示唆された。

開催年月日： 2019年12月

記述言語：日本語   会議種別：シンポジウム・ワークショップ パネル（公募）  

開催地：東京都   国名：日本国  

超高齢社会を迎えた現代社会において、健康寿命の延伸は重要な課題である。特に女性の平均寿命は高く、女性 の健康維持に取り組むことは超高齢社会の様々な課題解決にも貢献する。閉経後の女性は、骨粗鬆症だけでなく 肥満を引き起こしやすい。閉経後の肥満は高血圧や心臓病などの心血管障害だけでなく、乳がん、子宮頸がんの リスクも高くなることが報告されており、メタボリックシンドロームやロコモティブシンドロームを予防するこ とは健康寿命の延伸につながる。我々はこれまでの転写因子 NF-Bの骨代謝における役割について研究を進める中 で、 NF-Bの非古典的シグナル伝達経路に重要な NF-B inducing kinase(NIK)に機能欠失型変異を有する aly/alyマ ウスが破骨細胞数の有意な減少を伴う中程度の大理石骨病を呈することを報告した。この結果は、 NIKが骨粗鬆症 治療の有効な標的分子になる可能性を示唆する。そこで我々は、卵巣摘出(OVX)手術を施した骨粗鬆症モデルマウ スに新規 NIK阻害剤( Cpd33)を投与した。 Cpd33の投与は、 OVXによる骨量減少の抑制だけでなく、体重増 加も有意に抑制した。各組織を調べたところ、内臓脂肪量の増加が抑制され、子宮の大きさは Vehicle同様萎縮が 見られたことから、 Cpd33投与による骨量減少と体重増加の抑制は、エストロゲンシグナルを活性化しているこ とではないと考えられる。これらの結果から、 NIKが、閉経後に誘発される骨粗鬆症と肥満の双方に関与する「共 通分子」であることが想定され、さらに NIKがメタボリックシンドロームやロコモティブシンドロームの予防に有 効な標的分子になる可能性が示唆された。現在、組織学的解析及び代謝制御に関わる分子の発現量等の解析を進 めている。

開催年月日： 2019年12月

記述言語：日本語   会議種別：シンポジウム・ワークショップ パネル（公募）  

開催地：東京都   国名：日本国  

Gタンパク質共役型受容体の1つである GPRC6Aは膵ベータ細胞をはじめ、精巣、消化管、脂肪組織、脳など全 身に広く分布し、アミノ酸、細胞外 Caイオンのほか、テストステロンや骨基質タンパク質であるオステオカルシ ン( GluOC)などの多様な分子をリガンドとして認識する。 GPRC6A欠損マウスは食餌誘発性肥満とそれに伴う インスリン抵抗性を来たしやすいことから、 GPRC6Aシグナリングのエネルギー代謝への関与が強く示唆されて いる。我々は、野生型マウスに GPRC6Aのリガンドである GluOCを長期にわたって経口投与すると脂肪細胞が顕 著に小型化することを明らかにしている。また、培養脂肪細胞を GluOC 存在下で培養した時、脂肪細胞への分化 に中心的な役割を果たす転写因子 PPARgの発現が亢進し、インスリン感受性増強作用をもつアディポネクチン分 泌が促進されること、さらにそこへ至る GPRC6Aを介したシグナル伝達経路を明らかにしている(1)。今回 我々は、脂肪細胞における GPRC6Aシグナリングが全身の糖・脂質代謝改善における最も重要なターゲットであ ると位置づけ、成熟脂肪細胞特異的 GPRC6Aノックアウトマウス( GPRC6A cKO)を作製して解析した。 GPRC6A cKOを普通食で飼育しても対照群と相違は見られなかったが、高脂肪高ショ糖食で飼育すると、対照群 と比較して著しい脂肪細胞の肥大とそれに伴う脂肪組織重量の増加、肝臓への脂肪の蓄積、インスリン抵抗 性、耐糖能の悪化が認められた。脂肪分解に関わる酵素群の転写を制御する FOXO1, IRF4とその下流のリ パーゼ、 HSL、 ATGLの発現量が低下していたことから、 GPRC6Aを介したシグナリングは脂肪分解を制御する ことで全身の脂肪量を調整している可能性が示唆された。(1)T. Otani, et al., Cell Signal, 27, p532-544 (2015)

開催年月日： 2019年11月

記述言語：日本語   会議種別：口頭発表（一般）  

開催地：福岡市   国名：日本国  

【目的】 　現代社会では健康寿命が延伸し慢性疾患を抱えた患者が増加しているが，中でも慢性関節リウマチや骨粗鬆症等の骨吸収の亢進を伴う疾患が高い有病率を占めている．歯科における骨吸収亢進を伴う疾患として歯周病や根尖性歯周炎が挙げられる．これらの疾患において過度な免疫応答で増悪した骨吸収領域は通常の治療では治らないことも多い．治癒へと誘導するうえで免疫応答を適度に制御する必要性があるが，この考え方は新たな骨吸収阻害薬開発の基盤となっている．これまでの研究結果より，我々は治療標的としての可能性がある経路として転写因子NF-κBの非古典的シグナル伝達経路を選別した経路に焦点を当てた研究を進めている．NF-κBにはIκBαの分解を伴う古典的経路とNF-κB inducing kinase（NIK）の活性化を伴う非古典的経路の２つの活性化経路が存在すること，破骨細胞分化誘導因子receptor activator of NF-κB（RANKL）はこの２つの経路両方を活性化することが知られている．我々は，NF-κB誘導性キナーゼ（NIK）に変異を有しp100からp52のプロセシングが起きない機能欠失型免疫不全マウスaly/alyマウスが破骨細胞数の有意な減少を伴う軽度の大理石骨病を呈することを以前に明らかにしており，この骨量の増加は破骨細胞数の減少に起因することからNIKの機能を阻害することで骨吸収を抑制することを考えた．本研究では，新規NIK阻害剤の破骨細胞形成および骨吸収機能に対する抑制効果について検討した． 【材料及び方法】 本研究は九州大学動物実験委員会の承認を得て行った（A30-217-0）．5-6週令の雄性C57BL/6Jマウスの脛骨および大腿骨より骨髄細胞を調製しNIK阻害剤で前処理した後，M-CSFおよびRANKL存在下で培養して破骨細胞を誘導した．培養７日目に酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ（TRAP）染色を行いTRAP陽性多核細胞を破骨細胞として計測した．また，カテプシンKやDC-STAMPなどの破骨細胞分化マーカーの発現量の変化をReal-time PCR法で確認した．骨髄細胞をNIK阻害剤前処理後にRANKLで刺激し経時的にタンパク質を回収した．NIK阻害剤による古典的および非古典的経路の活性化はウエスタンブロッティング法を用いそれぞれIκBα分解とp100限定分解の解析で評価した．NFATc1の発現量の変化もウエスタンブロッティング法にて評価した．加えて，マウス骨髄間質細胞株ST2細胞と骨髄細胞の共存培養における1α25（OH）2D3/デキサメタゾン誘導性破骨細胞形成に対する効果を検討するとともに，骨吸収に対する効果をPit formation assayで検討した． 【結果】 NIK阻害剤は骨髄細胞単独培養および共存培養のいずれにおいても細胞増殖に影響を与えず濃度依存的に破骨細胞形成と分化マーカーの発現を抑制した．また，NIK阻害剤はRANKL刺激によるIκBαの分解には影響せず，p100の限定分解を抑制した．さらに，成熟破骨細胞にNIK阻害剤を添加したところ，破骨細胞数に影響せずに吸収窩形成を抑制した． 【考察】 NIK阻害剤はNF-κBの非古典的経路を選択的に阻害し細胞にダメージを与えることなく破骨細胞分化および骨吸収を抑制した．以上の結果は，骨破壊を伴う疾患の治療においてNIK阻害剤が骨破壊を抑制し治癒を促進する薬剤として応用可能であることを示唆している． 【結論】 NIK阻害剤はNF-κBの非古典的経路を選択的に阻害することで破骨細胞分化および骨吸収を抑制する．

開催年月日： 2019年10月

記述言語：日本語   会議種別：口頭発表（一般）  

開催地：東京都   国名：日本国  

開催年月日： 2019年10月

記述言語：日本語   会議種別：シンポジウム・ワークショップ パネル（公募）  

開催地：東京都   国名：日本国  

【目的】 　骨粗鬆症や歯周炎では、破骨細胞形成が亢進し骨破壊がおこる。転写因子NF-κB（nuclear factor-kappaB）は、炎症反応や免疫応答における遺伝子発現ならびに、破骨細胞分化誘導因子RANKL（receptor activator for NF-κB ligand）誘導性の破骨細胞形成を調節する。RANKLは、古典的および非古典的NF-κBシグナル伝達経路の両方を活性化する。非古典的NF-κBシグナル伝達経路の活性化ではNIK（NF-κB inducing kinase）の活性化を伴う。我々は、非古典的経路を構成するNIKの不活性型のためにp100からp52のプロセシングが起きないaly/alyマウスが、破骨細胞数の有意な減少を伴う軽度の大理石骨病を呈することを報告した。これらの結果から、破骨細胞形成を抑制するターゲットとしてNIKに注目し、新規NIK阻害剤Compound33（Cpd33）の破骨細胞形成におよぼす効果をin vitro、in vivoにて検討した。 Cpd33は、p100からp52へのプロセシングを阻害することによって、マウス由来骨髄細胞を用いた初代細胞培養系においてRANKL誘発破骨細胞形成および破骨細胞分化マーカーの発現を用量依存的に抑制した。同様にマウス骨髄間質細胞株ST２細胞とマウス由来骨髄細胞の共存培養においても、破骨細胞形成を抑制した。また、1 MのCpd33は、骨髄細胞の細胞増殖に影響を与えず，破骨細胞骨吸収を抑制した。そして、閉経性骨粗鬆症モデルにおいて、Ｃpd33は海綿骨の減少をレスキューした。以上の結果より、NIK阻害剤は骨破壊に対する治療に有用であることが示唆された。

開催年月日： 2019年10月

記述言語：日本語   会議種別：口頭発表（一般）  

開催地：東京都   国名：日本国  

開催年月日： 2019年6月

記述言語：英語   会議種別：シンポジウム・ワークショップ パネル（公募）  

開催地：バンクーバー   国名：カナダ  

【Objectives】 In periodontitis diseases or arthritis, increased osteoclastic bone resorption induced by excessive immune responses leads to bone destruction. Transcription factor NF-κB regulates gene expression during immune responses as well as receptor activator of NF-κB ligand (RANKL)-induced osteoclastogenesis. RANKL activates both the canonical and the no-canonical NF-κB signaling pathway. Activation of NF-κB inducing kinase (NIK) occurs in the non-canonical pathway. Alymphoplasia (aly/aly) mice, in which the processing of p100 to p52 does not occur because of an inactive form of NIK, showed mild osteopetrosis with significantly reduced osteoclast numbers. These results led us to examine the effects of new NIK inhibitor (Cpd33) on RANKL-induced osteoclastogenesis. 【Methods】 Bone marrow cells (BM cells) were isolated from 5 to 6 week old male C57BL/6 mice and cultured with M-CSF and RANKL for 7 days. Cultures were stained by TRAP, and TRAP+ MNCs was counted. Changes in expression level of osteoclast differentiation markers were measured by Real-time PCR. Activation of the NF-κB pathways evaluated the degradation of IκBα and the processing of p100 by Western blotting. The effect of Cpd33 on 1α25 (OH) 2D3 / dexamethasone induced osteoclast formation in co-culture of mouse bone marrow stromal cell line ST2 cells and BM cells was examined by TRAP staining. The effect on bone resorption function was examined by pit formation assay. 【Results】 Cpd33 suppressed RANKL-induced osteoclastogenesis, co-cultures of ST2 cells/BMcells, and the expression of osteoclastic differentiation markers in a dose-dependent manner by inhibiting the processing from p100 to p52, but not degradation of IκBα. Furthermore, Cpd33 suppressed osteoclastic bone resorption. 【Conclusions】 NIK inhibitor (Cpd33) might useful for the treatment with bone destruction induced by excessive immune responses, such as periodontitis diseases and arthritis.

開催年月日： 2019年3月

記述言語：英語   会議種別：シンポジウム・ワークショップ パネル（公募）  

開催地：福岡市   国名：日本国  

骨基質タンパクのオステオカルシン(OC)は特に非カルボキシル化OC (GluOC)の形態で糖・エネルギー代謝を活性化させるホルモンとしての作用があることが知られるようになった。我々は、脂肪細胞に1～10 ng/mlのGluOCを作用させると、脂肪細胞は小型化し、糖脂質代謝活性化ホルモンであるアディポネクチンの発現が亢進すること、およびそのシグナル伝達経路を解明した。その過程で、20 ng/ml以上の高濃度のGluOCでは逆にアディポネクチンの分泌が著しく抑制されることを確認すると共に、形態学的観察から、核の膨化および細胞膜の破綻といったネクローシスのような細胞死を認めたため、高濃度GluOC誘導性のネクローシスであることから、ネクロトーシス(プログラム化されたネクローシス)である可能性に気付いた。本研究では、そのシグナル伝達経路を検討した。初めに、高濃度GluOCはその受容体の候補として知られるGタンパク質共役型受容体であるGPRC6Aに結合し、細胞内のcAMP濃度を上昇させる。続いてPKA触媒サブユニットの核内局在が亢進し、核内のSIK2が不活化し、そのターゲットである転写共役因子のp300のSer89の脱リン酸化が亢進する。これにより活性化したp300はCREBによるFoxO1の発現量を亢進させる。このFoxO1によりデス因子であるFasLの発現量が亢進すると共に、細胞膜局在も起こる。続いて、細胞膜上に発現したFasLに対して隣在する脂肪細胞のFas受容体が結合する。これにより、脂肪細胞のFasシグナルが活性化し、その下流にあるネクロトーシスのメディエーターの1つであるMLKLのThr357/Ser358のリン酸化および三量体化の亢進、カルシウム流入の亢進、ROSおよび過酸化脂質の増加、そしてミトコンドリアダイナミクスのメディエーターであるDRP1のSer637の脱リン酸化亢進によるミトコンドリア分裂が引き起こされる。以上の分子メカニズムにより最終的に脂肪細胞にネクロトーシスが誘導されるという結果を得た。

開催年月日： 2018年11月

記述言語：日本語   会議種別：口頭発表（一般）  

開催地：京都市   国名：日本国  

【目的】 　歯周病や根尖性歯周炎，関節炎では過度な免疫応答によって，破骨細胞形成が亢進し骨吸収がおこる．近年，治療法や使用機器の進歩により治癒に至る症例は増加しているが，病態が進行し過大な骨欠損が認められる症例では通法のみでは治癒せず，難治化することも少なくない．骨吸収は破骨細胞の数の増加や過剰な骨吸収の亢進によって引き起こされる．免疫応答において主要な役割を果たす転写因子NF-κBは、免疫応答中の遺伝子発現ならびに破骨細胞分化誘導因子RANKL（Receptor activator of NF-κB）による破骨細胞形成を調節する．NF-κBの活性化経路にはIκBαの分解を伴う古典的経路とNF-κB inducing kinase（NIK）の活性化による非古典的経路が存在する．RANKLはこれらの２つの経路を活性化する．我々は，NIKに変異を有し，p100からp52のプロセシングが起きない機能欠失型免疫不全マウスaly/alyマウスが，破骨細胞数の有意な減少を伴う軽度の大理石骨病を呈することを報告した．（MARUYAMA T et al.,2010,J Bone Miner Res 25：1058）．この骨量の増加は主に破骨細胞数の減少に起因することから，NIKの機能を阻害することで過度な骨吸収を抑制することを考えた．本研究では，新規NIK阻害剤Cpd33の破骨細胞形成に対する抑制効果について検討した．なお，本研究は九州大学動物実験委員会の承認を得て行った． 【材料及び方法】 5-6週令の雄性C57BL/6マウスの脛骨および大腿骨より骨髄細胞を調製し，Cpd33で前処理した後，RANKLで刺激し，破骨細胞を誘導した．培養７日目に酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ（TRAP）染色を行い，TRAP陽性多核細胞を破骨細胞として計測するとともに，カテプシンKやDC-STAMPなどの破骨細胞分化マーカーの発現量の変化をReal-time PCR法で確認した．また，骨髄細胞をCpd33で前処理した後，RANKLで刺激し，経時的にタンパク質を回収した．古典経路および非古典的経路の活性化はそれぞれIκBαの分解とp100のプロセシングをウェスタンブロッティング法で評価した．さらに，マウス骨髄間質細胞株ST2細胞と骨髄細胞を共存培養し，Cpd33で前処理した後，1α,25（OH）2D3およびデキサメタゾン添加により破骨細胞形成を誘導した． 【結果】 　Cpd33は濃度依存的に骨髄細胞からTRAP陽性破骨細胞への分化を抑制し，さらに破骨細胞分化マーカーの発現を抑制した．Cpd33は1 μMの濃度で破骨細胞の分化をほぼ完全に抑制したが，この濃度では細胞障害性は確認されなかった．骨髄細胞およびST細胞の共存培養もCpd33はRANKLおよびOPGの発現に影響することなく，破骨細胞形成を抑制した．また，Cpd33はRANKL刺激によるIκBαの分解には影響せず，p100のプロセシングを抑制した．RANKL誘発破骨細胞形成および破骨細胞分化マーカーの発現を用量依存的に抑制したが，IκBαの分解は抑制しなかった． 【考察】 　Cpd33はNF-κBの非古典的経路を選択的に阻害し，細胞にダメージを与えることなく破骨細胞分化を抑制した．以上の結果より、Cpd33は難治化した根尖性歯周炎や重度歯周炎の症例における，過度な免疫応答によって誘導される骨破壊に対する治療に有用であることが示唆された． 【結論】 Cpd33は，NF-κBの非古典的経路を選択的に阻害することで破骨細胞分化を抑制する．

開催年月日： 2018年9月

記述言語：日本語   会議種別：シンポジウム・ワークショップ パネル（公募）  

開催地：京都市   国名：日本国  

骨基質タンパクのオステオカルシン(OC)は特に非カルボキシル化OC (GluOC)の形態で糖・エネルギー代謝を活性化させるホルモンとしての作用があることが知られるようになった。我々は、脂肪細胞に1～10 ng/mlのGluOCを作用させると、脂肪細胞は小型化し、糖脂質代謝活性化ホルモンであるアディポネクチンの発現が亢進すること、およびそのシグナル伝達経路を解明した。その過程で、20 ng/ml以上の高濃度のGluOCでは逆にアディポネクチンの分泌が著しく抑制されることを確認すると共に、形態学的観察から、核の膨化および細胞膜の破綻といったネクローシスのような細胞死を認めたため、高濃度GluOC誘導性のネクローシスであることから、ネクロトーシス(プログラム化されたネクローシス)である可能性に気付いた。本研究では、そのシグナル伝達経路を検討した。初めに、高濃度GluOCはその受容体の候補として知られるGタンパク質共役型受容体であるGPRC6Aに結合し、細胞内のcAMP濃度を上昇させる。続いてPKA触媒サブユニットの核内局在が亢進し、核内のSIK2が不活化し、そのターゲットである転写共役因子のp300のSer89の脱リン酸化が亢進する。これにより活性化したp300はCREBによるFoxO1の発現量を亢進させる。このFoxO1によりデス因子であるFasLの発現量が亢進すると共に、細胞膜局在も起こる。続いて、細胞膜上に発現したFasLに対して隣在する脂肪細胞のFas受容体が結合する。これにより、脂肪細胞のFasシグナルが活性化し、その下流にあるネクロトーシスのメディエーターの1つであるMLKLのThr357/Ser358のリン酸化および三量体化の亢進、カルシウム流入の亢進、ROSおよび過酸化脂質の増加、そしてミトコンドリアダイナミクスのメディエーターであるDRP1のSer637の脱リン酸化亢進によるミトコンドリア分裂が引き起こされる。以上の分子メカニズムにより最終的に脂肪細胞にネクロトーシスが誘導されるという結果を得た。

開催年月日： 2018年9月

記述言語：日本語   会議種別：口頭発表（一般）  

開催地：福岡市   国名：日本国  

背景・目的】オステオカルシンは，ヒトでは 49 個のアミノ酸からなる分子量約 5900 の非コラー ゲン性骨基質タンパク質である.オステオカルシンは骨芽細胞によって産生されるため，骨の代 謝回転の指標として用いられる.一方近年，オステオカルシンはホルモンとしてエネルギー代謝 調節などに関与することも明らかにされ，注目を集めている.オステオカルシンの受容体の候補 として三量体 G タンパク質共役型受容体である GPRC6A が同定されているが，直接的な結合は 未だ示されていない.本研究ではオステオカルシンと相互作用する分子を同定し，オステオカル シン受容体である可能性について考察する.【方法】マウスの骨格筋，大脳，小脳，脂肪の組織を 摘出後破砕し，遠心分離した.可溶性画分と，別に精製した組換えタンパク質である GST 融合オ ステオカルシン(GST-GluOC)とを混合，または GST のみとを混合して Pull down assay をしたの ち電気泳動して銀染色を行った.GST-GluOC との混合において特異的に検出されたバンドにつ いて質量分析を行い，その分子の同定を試みた.また，COS7 細胞に GPRC6A を発現させ，免疫 蛍光染色およびオステオカルシンを用いた Binding assay を行い，GPRC6A の局在およびオステオ カルシンとの結合について観察した.【結果と考察】Pull down assay および質量分析により，GST- GluOC と直接的な結合を示す特定の分子が存在することが示唆された.また，免疫染色によりヒ ト GPRC6A が細胞膜に一部局在していることを観察した.

開催年月日： 2018年9月

記述言語：日本語   会議種別：口頭発表（一般）  

開催地：福岡市   国名：日本国  

歯周炎や関節炎では、過度の免疫応答によって破骨細胞形成が亢進し骨破壊をもたらす。転写因子NF-κBは、免疫応答中の遺伝子発現ならびに破骨細胞分化誘導因子（RANKL）誘導性の破骨細胞形成を調節する。RANKLは、古典的およびオルタナティブNF-κBシグナル伝達経路の両方を活性化する。我々は、NF-κB誘導性キナーゼ（NIK）の不活性型のためにp100からp52のプロセシングが起きないaly/alyマウスが、破骨細胞数の有意な減少を伴う軽度の大理石骨病を呈することを報告した。これらの結果から、我々は新しいNIK阻害剤のRANKL誘導性の破骨細胞形成におよぼす効果を試験することにした。 NIK阻害剤は、p100からp52へのプロセシングを阻害することによって、骨髄（BM）細胞からのRANKL誘発破骨細胞形成および破骨細胞分化マーカーの発現を用量依存的に抑制したが、IκBαの分解は抑制しなかった。 NIK阻害剤はまた、マウス骨髄間質細胞株ST2細胞と骨髄細胞の共存培養に、1α、25（OH）2D3とデキサメタゾンを添加することによって誘導される破骨細胞形成も抑制した。 1 μMのNIK阻害剤は、骨髄細胞およびST細胞の細胞増殖に影響を与えなかった。さらにNIK阻害剤は破骨細胞骨吸収を抑制した。以上の結果より、NIK阻害剤は、歯周炎や関節炎などの過度の免疫応答によって誘導される骨破壊による治療に有用であることが示唆された。

開催年月日： 2018年9月

記述言語：日本語   会議種別：シンポジウム・ワークショップ パネル（公募）  

開催地：福岡市   国名：日本国  

G タンパク質共役型受容体の 1 つである GPRC6 A は膵 β 細胞をはじめ，精巣，消化管，脂肪組 織，脳など全身に広く分布し，アミノ酸，細胞外 Ca2+のほか，テストステロンや骨基質タンパク 質であるオステオカルシン(GluOC)などの多様な分子をリガンドとして認識する.GPRC6 A 欠 損マウスは食餌誘発性肥満とそれに伴うインスリン抵抗性を来たしやすく，GPRC6 A シグナリ ングのエネルギー代謝への関与が強く示唆されている.我々は，野生型マウスに GPRC6 A のリ ガンドである GluOC を長期にわたって経口投与すると脂肪細胞が顕著に小型化することを明ら かにした.また，前駆脂肪細胞株 3 T3-L1 を脂肪細胞に分化させ，GluOC を添加すると 脂肪細 胞への分化に中心的な役割を果たす転写因子 PPARγ の発現が亢進し，インスリン感受性増強作 用をもつアディポネクチン分泌が促進されることと，そこに至る GPRC6 A を介したシグナル伝 達経路を明らかにした.今回我々は，脂肪細胞における GPRC6 A シグナリングが全身の糖・脂質 代謝改善における最も重要なターゲットであると位置づけ，成熟脂肪細胞特異的 GPRC6 A ノッ クアウトマウス(GPRC6 A cKO)を作製して解析した.GPRC6 A cKO を普通食で飼育しても対照 群と相違は見られなかったが，高脂肪高ショ糖食で飼育すると，対照群と比較して著しい脂肪細 胞の肥大とそれに伴う脂肪組織重量の増加，肝臓への脂肪の蓄積，インスリン抵抗性，耐糖能の 悪化が認められた.脂肪分解に関わる酵素群の転写を制御する IRF4 とその下流のリパーゼ，HSL， ATGL の発現量が低下していたことから，GPRC6 A を介したシグナリングは脂肪分解と脂質生 合成のバランスを制御することで全身の脂肪量を調整している可能性が示唆された.

開催年月日： 2017年12月

記述言語：日本語   会議種別：シンポジウム・ワークショップ パネル（公募）  

開催地：神戸   国名：日本国  

開催年月日： 2017年12月

記述言語：日本語   会議種別：シンポジウム・ワークショップ パネル（公募）  

開催地：神戸   国名：日本国  

PRIP ［phospholipase C (PLC) related but catalytically inactive protein］ は、Ins(1,4,5)P3 結合性分子として見いだされた、種間で高度に保存されたタンパク質である。PRIP欠損（KO）マウスにおいて骨量増加が認められたことから、骨代謝機構におけるPRIPの機能について解析を行ってきた。野生型（WT）に比べKOマウスでは、骨芽細胞への分化能が高いことによる骨形成量の増加が見られる一方、破骨細胞の接着や機能に異常が見られた。また、マウスを用いた矯正的歯の移動の解析より、WTに比べKOでは、歯の移動量および破骨細胞数の減少が見られた。そこで、破骨細胞形成におけるPRIPの役割について解析を行った。WTおよびKOの骨髄細胞および前骨芽細胞との共存培養による破骨細胞への分化誘導の解析から、分化した破骨細胞数は骨髄細胞がKO由来の場合のみ減少した。分化誘導に重要なM-CSFとRANKLの各受容体の膜発現を検討したところ、KO細胞において減少していた。また、破骨細胞の分化制御および機能に関わる種々の遺伝子の発現も減少していた。カルシニューリンのタンパクレベルでの発現量と活性もKO細胞で有意に低下していた。破骨細胞分化のマスターレギュレーターである転写因子NFATc1の細胞内局在を検討したところ、WTに比べKO細胞では、破骨細胞分化に伴うNFATc1の核移行量が減少していた。しかし、細胞内カルシウム濃度を強制的に上昇させたところ、KO細胞におけるNFATc1の核内移行と破骨細胞の形成は回復した。これらの結果から、PRIP欠損により破骨細胞分化に必要十分な細胞内カルシウム濃度 の上昇が起こりにくくなっていることが示唆された。PRIPは、カルシウムを介してcalcium-calcineurin-NFATc1シグナリングを調節することにより破骨細胞分化を正に制御することが明らかとなった。

開催年月日： 2017年10月

記述言語：日本語   会議種別：シンポジウム・ワークショップ パネル（公募）  

開催地：札幌   国名：日本国  

PRIP［phospholipase C (PLC) related but catalytically inactive prote in］は、PLC に類似の構造を有するが酵素活性を持たない新規のIns(1,4,5)P3 結合 蛋白質として発見された。PRIP欠損マウスにおいて、海綿骨の骨量が増加しているこ とから、骨代謝の亢進により骨量が増加していると考えられている。マウスを用いて 矯正的歯の移動を行ったところ、野生型に比べてPRIP欠損型では、歯の移動量の減少 および破骨細胞数の減少が見られた。そこで、骨吸収におけるPRIPの役割について細 胞生物学的解析を行った。【資料および方法】実験にはPRIP欠損マウスおよび野生型 マウスをそれぞれ、各実験において３匹以上用いた。両者の大腿骨から採取した骨髄 細胞をM-CSFで３日培養した前破骨細胞、さらにRANKLで４日間培養した破骨細胞から RNAを抽出し、破骨細胞分化制御に関与する遺伝子群の発現をリアルタイムPCRを用い て解析した。同様に、骨髄細胞、前破骨細胞のカルシニューリンの発現量と活性を測 定した。また、破骨細胞に分化させる過程で、NFATc1の核移行を蛍光免疫染色法にて 解析した。さらに、thapsigarginを用いたレスキュー実験を行った。【結果および考 察】リアルタイムPCR法の結果、PRIP欠損型では破骨細胞の分化制御に関わる種々の 遺伝子の発現が減少した。カルシニューリンの発現量と活性もPRIP欠損型で有為に減 少した。蛍光免疫染色法の結果、NFATc1は野生型に比べ、PRIP欠損型では、核内へ移 行している量が有為に減少した。さらに、thapsigarginによって細胞質内のカルシウ ム濃度を強制的に上昇させたところ、PRIP欠損型での破骨細胞の形成とNFATc1の核内 移行は回復した。【結論】これらの結果より、PRIPはcalcium-calcineurin-NFATc1シ グナル伝達経路を調節することによって破骨細胞の分化を制御することが明らかとな った。この制御を通してPRIPは骨代謝において重要な役割を担っていることが示唆さ れた。

開催年月日： 2016年8月

記述言語：日本語   会議種別：シンポジウム・ワークショップ パネル（公募）  

開催地：札幌   国名：日本国  

PRIP (phospholipase C-related, but catalytically inactive protein) は、酵素活性を有しない情報伝達分子である。PRIP欠損（KO）雌マウスでは、出産仔数の低下及び性腺刺激ホルモンや性ステロイドホルモンの分泌異常を示した事から骨組織への影響について解析した。その結果、海綿骨の骨量増加が認められ、PRIPが骨芽細胞分化において抑制的に機能する事が判明した。一方、生殖機構の解析を進め、卵巣機能におけるPRIPの役割を検討した。野生型（WT）及びKO雌マウスにおいて過排卵処理を施し排卵数を調べたところ、その数はKOでWTの約20%程度であった。排卵に必須のCumulus-oocyte-complex (COC)（卵丘細胞-卵子複合体）の膨潤能を検討したところ、黄体形成ホルモン（LH）サージ様の薬剤刺激によりKOでも正常なCOC複合体の膨潤が認められた。遺伝子発現変化をmicroarray及びreal-time PCRで解析したところ、排卵前後で排卵関連遺伝子群に顕著な発現量増加が見られたが、WTとKOで有意差はなかった。以上より、PRIP欠損は排卵に至る卵胞成熟過程に影響する事が示唆された。組織学的解析から、KOの卵巣では出血を伴った嚢胞がしばしば見られ、卵胞成熟誘発後でも未成熟卵胞が多くて成熟卵胞・黄体は少なかった。また、成熟卵胞の顆粒膜細胞に発現するLH受容体が、KOでは未成熟卵胞でも見られ、その発現量及びLH受容体下流のシグナル分子のリン酸化が亢進していた。更に、KOで血中エストロゲン (E2) 濃度は低下していたが、卵巣内の残存E2量は多く、産生量はWTと同等であることが推定された。以上の結果から、PRIP欠損は卵巣においてLHシグナルの亢進及びE2分泌の低下を惹起して早期の卵胞成熟過程が抑制されると考えられた。

開催年月日： 2016年2月

記述言語：英語   会議種別：シンポジウム・ワークショップ パネル（公募）  

開催地：福岡   国名：日本国  

開催年月日： 2016年2月

記述言語：英語   会議種別：シンポジウム・ワークショップ パネル（公募）  

開催地：バンコク   国名：タイ王国  

開催年月日： 2015年12月

記述言語：日本語   会議種別：シンポジウム・ワークショップ パネル（公募）  

開催地：神戸   国名：日本国  

Phospholipase C-related but catalytically inactive protein (PRIP) was first identified as an inositol 1,4,5-trisphosphate binding protein. We generated PRIP gene-deficient (PRIP-KO) mice and reported that PRIP-KO mice exhibited the upregulation of the bone mineral density and trabecular bone volume, due to the enhancement of bone formation while decreased bone resorption. In this study, we investigated the possible mechanisms by which PRIP regulates bone resorption. Orthodontic tooth movement was performed using wild type (WT) and PRIP-KO mice equipped with orthodontic devices and analyzed by micro-computed tomography and TRAP staining. In the mutant mice, tooth movement was reduced compared with wild type (WT) mice, and osteoclasts were observed at the lesser amount on pressure side in KO maxillary bones. In vitro osteoclast formation assay and flow cytometric analysis were also performed and revealed the decreased differentiation for osteoclast in bone marrow cells isolated from KO mice. Gene expression implicated in osteoclast differentiation and bone resorption and the transcription factors were decreased in KO mice. Immunoblot analysis using cultured bone marrow cells indicated the lower expression of calcineurin in KO cells, and calcineurin phosphatase activity assay showed the reduction in KO cells. These results suggest that PRIP positively regulates osteoclast differentiation, especially in the early stage, probably through calcium-calcineurin-NFAT signaling.

開催年月日： 2015年10月

記述言語：英語   会議種別：シンポジウム・ワークショップ パネル（公募）  

開催地：福岡   国名：日本国  

開催年月日： 2015年10月

記述言語：英語   会議種別：シンポジウム・ワークショップ パネル（公募）  

開催地：福岡   国名：日本国  

Objectives Phospholipase C-related but catalytically inactive protein (PRIP) was first isolated as an inositol 1,4,5-trisphosphate binding protein. We generated PRIP gene-deficient (PRIP-KO) mice and found that PRIP-KO mice exhibited the upregulation of the bone mineral density and trabecular bone volume, due to an enhancement of the bone formation. In this study, we investigated the possible mechanisms by which PRIP regulates bone resorption. Methods Orthodontic tooth movement was executed using wild type (WT) and PRIP-KO mice equipped with orthodontic devices and analyzed by micro-computed tomography and TRAP staining. In vitro osteoclast formation assay and flow cytometric analysis were also performed using bone marrow cells from the femurs of both genotypes. Osteoclastic genes expression was analyzed by realtime PCR and western blotting. Calcineurin phosphatase activity was measured using cell lysates extracted from bone marrow cells and preosteoclast cells. Results Tooth movement was reduced in KO compared with WT mice and the osteoclasts were observed at the lesser amount on pressure side in KO maxillary bones. Osteoclast differentiation in bone marrow cells isolated from KO mice was decreased in vitro cultures. Gene expression implicated in osteoclast differentiation and bone resorption and the transcription factor PU.1 and NFATc1 were decreased in KO mice. The expression and the activity of calcineurin were lower in KO bone marrow and preosteoclast cells. Conclusions PRIP deficiency induces the inhibition of osteoclast differentiation, especially at the early stage, probably through the impairment of calcium-calcineurin-NFAT signaling.

開催年月日： 2015年10月

記述言語：英語   会議種別：シンポジウム・ワークショップ パネル（公募）  

開催地：福岡   国名：日本国  

Objectives: Phospholipase C-related but catalytically inactive protein (PRIP) was identified as an inositol 1,4,5-trisphosphate binding protein and has other binding partners to be involved in several cellular signaling. PRIP deficient (PRIP-KO) mice exhibit the increased bone mineral density and trabecular bone volume, indicating that PRIP is implicated in the regulation of bone properties. In this study, we investigated the possible mechanisms by which PRIP plays a role in bone morphogenetic protein (BMP) signaling. Methods: Primary cells isolated from calvaria prepared from wild type (WT) and PRIP-KO mice were used to osteoblast differentiation induced by BMP stimulation, and alkaline phosphatase staining and the activity assay were performed. Id1 promoter activity of reporter construct in preosteoblast was examined by luciferase assay. Osteoblastic genes expression or protein phosphorylation was analyzed by realtime PCR and/or western blotting. Immunofluorescent staining was performed to reveal the localization of Smads in WT or KO cells with or without BMP. Results In PRIP-KO culture, enhanced osteoblast differentiation was observed on examining alkaline phosphatase staining and activity. The promoter activity of Id1 gene, responding immediately to BMP, was also more increased. Smad1/5 phosphorylation in response to BMP showed an enhanced peak and was more persistent in mutant cells, but the dephosphorylation process was not different between the two genotypes. The luciferase assay using calvaria cells transfected with the Smad1 mutated as a constitutive active form showed increased transcriptional activity at similar levels between the genotypes. The expression of BMP receptors was not different between the genotypes. BMP-induced phosphorylation of Smad1/5 was robustly decreased in wild type cells, but not in mutant cells, by pretreatment with DB867, an inhibitor of methyltransferase of inhibitory Smad6. Conclusions These results indicate that PRIP is implicated in BMP-induced osteoblast differentiation by the negative regulation of Smad phosphorylation, through the methylation of inhibitory Smad6.

開催年月日： 2014年9月

記述言語：日本語   会議種別：シンポジウム・ワークショップ パネル（公募）  

開催地：福岡   国名：日本国  

PRIP［phospholipase C (PLC) related catalytically inactive protein］は、PLC 酵素活性を有しない新規のシグナリング蛋白質として見いだされた。PRIP欠損（KO）マウスで海綿骨の骨量増加が認められたことから骨代謝機構におけるPRIPの機能について解析を行ってきた。野生型（WT）に比べKOマウスにおいては骨芽細胞への分化能が高いことによる骨形成量の増加が見られる一方、破骨細胞の接着や機能に異常が見られた。そこで、破骨細胞分化におけるPRIPの役割について解析を行った。WT、KOマウスの大腿骨および頭蓋骨より調製した骨髄細胞（BMC）、骨芽細胞前駆細胞（POB）を用いて共培養を行ったところ、分化した破骨細胞数が有意に減少するのはKOマウス由来の BMC を用いた場合である事が分かった。そこで、破骨細胞分化に必須のM-CSFおよびRANKLの受容体（CD115、RANK）についてその膜発現をFACSにて解析したところ、RANK/CD115陽性細胞数がM-CSFのみによる刺激の段階でKOで減少していた。破骨細胞分化および機能に関わる種々の分子群についてreal-time PCR解析を行ったところ、RANK を始めNFATc1や αVβ3インテグリンなど多くの分子の発現がPRIP-KOにおいて減少していた。これらのことから、破骨細胞分化の初期の段階でRANK遺伝子の発現量が低下しているために分化に低下が見られることが示唆された。RANKの発現はM-CSFにより促進されることから、PRIPがM-CSFシグナリングにおいて何らかの役割を担っていると考えられる。

開催年月日： 2013年12月

記述言語：日本語   会議種別：シンポジウム・ワークショップ パネル（公募）  

開催地：神戸   国名：日本国  

Phospholipase C-related catalytically inactive protein (comprising PRIP-1 and -2) was first identified as a novel inositol 1,4,5-trisphosphate binding protein, but the biological functions have remained elusive. We therefore generated PRIP-1 and -2 double knockout (DKO) mice and found their reduced fertility: DKO mice exhibited reduced fertility in the female such as decreased number of pups, longer estrous days, increased secretion of gonadotropins, etc. This time we examined the ability of the ovaries in response to gonadotropins: the total number of the ovulated oocytes were remarkably decreased in DKO female mice, indicating that PRIP plays an important role in follicle maturation and/or ovulation, but not fertilization or implantation. Microarray and quantitative real-time PCR analyses revealed the increased expressions of molecules involved in ovulation including Has2, Ptgs2, PTX3, Tnfaip6 and Areg in both genotype. We examined the ability of COC expansion in both genotypes but little difference was observed. On the other hand, histological analysis revealed more immature follicles and fewer mature follicles or corpus lutea in DKO ovaries. Immunological analysis showed the expression of luteinizing hormone receptors (LHR) at earlier stages of follicle maturation in DKO ovary, and elevated level of ERK phosphorylation in DKO granulosa cells. These results suggest that the appearance of LHR at immature follicle stages leads to suppress follicle maturation by excessive LH signaling in DKO ovary, indicating that PRIP may be involved in positive regulation of ovarian follicle maturation through LH signaling.

開催年月日： 2013年10月

記述言語：日本語   会議種別：シンポジウム・ワークショップ パネル（公募）  

開催地：松本   国名：日本国  

【目的】PRIP［phospholipase C (PLC) related inactive protein］はPLC 酵素活性を有しない新規のIns(1,4,5)P3 結合蛋白質として発見された。PRIP欠損マウスにおいて、海綿骨の骨量が増加していることから、骨代謝の亢進により骨量が増加していると考えられている。そこで本研究では、矯正的歯の移動に伴う歯槽骨リモデリング機構におけるPRIPの役割について解析を行った。 【材料および方法】実験にはPRIP欠損マウスおよび野生型マウスをそれぞれ、X匹およびY匹ずつ用いた。実験動物の上顎切歯と右側第一臼歯との間にニッケルチタン製のクローズドコイルスプリングを挿入し、矯正力を加え、歯を移動させた。X線マイクロCTスキャナにより、移動歯周囲の形態学的な解析を行った。また、移動歯および対照歯を含む歯槽骨の切片を作製し、ALPおよびTRAP染色を行い、組織学的解析を行った。さらに、野生型およびPRIP欠損マウスにおける破骨細胞の分化・成熟の相違について検討するために、両者の大腿骨から採取した骨髄細胞を用いて、膜分子であるRANK、および、CD115の発現をFACSによって解析を行った。 【結果】歯を移動したマウスの形態学的解析を行った結果、PRIP欠損マウスにおいては、野生型マウスに比べて有意に歯の移動距離が減少した。また、組織学的解析において歯槽骨の圧迫側の破骨細胞の分布に相違がみられた。FACSの結果、破骨細胞に分化すると考えられるRANK/CD115の陽性細胞数は、野生型マウスに比べ、PRIP欠損マウスにおいて減少していることが示された。 【考察および結論】これらの結果より、PRIP欠損マウスでは破骨細胞に異常があることがわかった。矯正力による歯の移動において、PRIPが歯槽骨リモデリングの制御に関与していることが示唆された。

開催年月日： 2013年9月

記述言語：日本語   会議種別：シンポジウム・ワークショップ パネル（公募）  

開催地：横浜   国名：日本国  

Phospholipase C-Related but Catalytically Inactive Protein（PRIP） は、イノシトール1,4,5-三リン酸(Ins(1,4,5)P3) に結合する分子として見いだされた。本分子の機能解明のためにこの遺伝子欠損マウス（PRIP-KOマウス） を作製し、骨組織を解析した。PRIP-KO マウスでは、μCT による大腿骨計測から海綿骨量の増加、並びに組織形態観察から骨密度および骨梁数の増加が認められた。更に、カルセイン二重標識による解析から骨形成速度の増加が見られた。これらの結果から、KO マウスにおける骨形成の亢進による骨量の増加が示唆された。次に、野生型マウスの骨芽細胞前駆細胞（preosteoblast,POB） に PRIP が発現することを確認し、野生型および PRIP-KO マウスから調製した POB を BMP4 で刺激したところ、アルカリホスファターゼ（ALP） 陽性の骨芽細胞数および ALP 活性が PRIP-KO マウスでは増加した。また、PRIP-KO マウス由来の POB において骨代謝関連分子（Id1 、Runx2、Osteonectin、Osteocalcin） の発現が有意に増加した。この結果は、PRIP が骨芽細胞分化を抑制していることを示唆する。PRIP が骨芽細胞分化に関わる分子基盤を求めて　BMP シグナルにおける PRIP の役割について解析を行った。野生型および PRIP-KO マウスの POB で BMP 受容体である BMPRⅠA および BMPRⅡ の発現量を検討したが有意な差異は認めなかった。次に、Smad1/5/8 の C 末端のリン酸化動態について検討したところ PRIP-KO マウスでは、より長時間持続した。これらの結果は PRIP が smad1/5/8 のリン酸化調節に関わることを示唆している。

開催年月日： 2012年12月

記述言語：日本語   会議種別：シンポジウム・ワークショップ パネル（公募）  

開催地：福岡   国名：日本国  

Phospholipase C-related catalytically inactive protein (comprising PRIP-1 and -2) was first identified as a novel inositol 1,4,5-trisphosphate binding protein, but the biological functions have remained elusive. We therefore generated PRIP-1 and –2 double knockout (DKO) mice to gain insight into the biological function. DKO mice exhibited reduced fertility in the female such as decreased number of pups, longer estrous days, increased secretion of gonadotropins, etc. We examined the ability of the ovaries in response to gonadotropins: the total number of the ovulated oocytes were remarkably decreased in DKO female mice, indicating that PRIP plays an important role in follicle maturation and/or ovulation, but not fertilization or implantation. Microarray and quantitative real-time PCR analyses revealed the increased expressions of molecules involved in ovulation including Has2, Ptgs2, PTX3, Tnfaip6 and Areg. We examined the ability of COC expansion in both genotypes but little difference was observed. On the other hand, histological analysis of ovaries from both genotypes revealed more immature follicles and fewer mature follicles or corpus lutea in DKO ovaries. Immunofluorescence analysis showed the expression of luteinizing hormone receptors (LHR) at earlier stages of follicle maturation in DKO ovary and more increase of antral follicles. These results are summarized as below: the increased LH secretion from pituitary gland and the appearance of LHR at immature follicle stages lead excessive LH signaling to suppress follicle maturation in DKO females, indicating that PRIP may be involved in positive regulation of ovarian follicle maturation through LH signaling.

開催年月日： 2012年12月

記述言語：日本語   会議種別：シンポジウム・ワークショップ パネル（公募）  

開催地：福岡   国名：日本国  

Phospholipase C-Related but Catalytically Inactive Protein（PRIP） は、イノシトール1,4,5-三リン酸(Ins(1,4,5)P3) に結合する分子として見いだされた。本分子の機能解明のためこの遺伝子欠損マウス（PRIP-KOマウス） を作製したところ、野生型に比べ出産頻度や１回当たりの出産仔数が少なく、性腺刺激ホルモンの分泌上昇や、性ホルモンの分泌低下など、生殖に関わる異常が明らかになった。これは閉経後女性に見られるホルモンアンバランスに類似しており、骨への影響が示唆されたことからマウス骨組織の解析を始めた。PRIP-KO マウスにおいて、μCT による大腿骨計測から海綿骨量の増加が見られ、組織形態観察から骨密度及び骨梁数の増加が認められた。また、カルセイン二重標識による解析において骨形成速度の増加が見られた。これらの結果から、骨形成の亢進により骨量が増加していることが示唆された。次に、野生型マウスの骨芽細胞前駆細胞（preosteoblast,POB） に PRIP が発現することを確認し、野生型及び PRIP-KO マウスから調製した POB を BMP4 で刺激したところ、PRIP-KO マウスにおいてアルカリホスファターゼ（ALP） 陽性の骨芽細胞数及びALP活性も増加した。また、PRIP-KO マウス由来の POB において骨代謝関連分子（Id1 、Runx2、Osteonectin、Osteocalcin） の発現が有意に増加した。この結果は、PRIP が骨芽細胞分化を抑制していることを示唆する。そこで、BMP シグナルにおける PRIP の役割について解析を始めた。野生型及び PRIP-KO マウスの POB において BMP 受容体である BMPRⅠA及び BMPRⅡ の発現量を検討したところ、有意差は見られなかった。次に、Smad1 のリンカー領域のリン酸化がC末端のリン酸化を制御するという報告から、Smad1/5/8 のC末端とリンカー領域のリン酸化動態について検討したが、野生型と PRIP-KO マウスでリン酸化レベルに有意差は見られなかった。そこで、Smad1/5/8 だけでなく BMP シグナリングに関わる他の分子（Smad4,pERK など） への影響も視野に入れ、現在更に解析を進めている。

開催年月日： 2012年12月

記述言語：日本語   会議種別：口頭発表（一般）  

開催地：福岡   国名：日本国  

PRIPは新規のIns(1,4,5)P3 結合蛋白質として見いだされた。ホスホリパーゼC—delta１（PLC-d1）と類似したドメイン構造構造（PH ドメイン、EF ハンドモチーフ、活性中心 X , Y ドメイン、C2 ドメイン）を持っているがPLCの酵素活性は持っていない。後に、タイプ２とも言える類似の分子が発見され、我々はこれらをPRIP［phospholipase C (PLC) related inactive protein］, PRIP-1とPRIP-2）と名付けた。 　PRIP欠損マウスにおいて、野生型に比べ破骨細胞・骨芽細胞が共に多く、海綿骨の骨量が増加している事から、骨代謝の亢進により骨量が増加していると考えられている。矯正力による歯牙移動では、圧迫側で骨が破骨細胞により吸収され、牽引側で骨芽細胞により骨が形成される。そこで本研究では、矯正力を加えた歯牙移動での歯槽骨リモデリング機構におけるPRIPの役割について解析することにした。 　マウスの上顎の切歯と右側第一大臼歯との間にニッケルチタンのオープンコイルスプリングを挿入し、矯正力を加え歯牙を移動させた。X線マイクロCTスキャナにより形態学的な解析を行った結果、PRIP欠損マウスは野生型マウスに比べて有為に歯牙移動距離が減少した。また、組織学的解析において歯槽骨の圧迫側の破骨細胞と、牽引側の骨芽細胞の分布に相違がみられた。 　これらの結果より、PRIPは矯正力による歯牙移動の歯槽骨リモデリングの制御に関与していることが示唆された。

開催年月日： 2012年9月

記述言語：英語   会議種別：シンポジウム・ワークショップ パネル（公募）  

開催地：Sevilla   国名：スペイン  

PRIP (PLC-Related, but catalytically Inactive Protein) は、Ins(1,4,5)P3 結合性の分子として見いだされた新規分子であり、種を越えて広く存在するタンパク質である。２つのサブタイプが存在し、PRIP-1は脳に多く発現しているのに対し、PRIP-2は比較的ユビキタスな発現パターンを示す。我々は、PRIP-1及びPRIP-2のダブルノックアウトマウスを作製し、

開催年月日： 2012年5月

記述言語：日本語   会議種別：シンポジウム・ワークショップ パネル（公募）  

開催地：福岡   国名：日本国  

PRIPは当研究室で見いだされた新規のシグナリング分子である。この遺伝子欠損マウス(PRIP-KO マウス)では、野生型(WT)に比べ、骨芽細胞の分化能が高いことによる骨形成量の増加が示された。そこで我々は、骨芽細胞の分化を制御するBone Morphogenetic Protein (BMP)シグナル伝達系におけるPRIPの機能について解析した。WT及びKOマウスの頭蓋冠より調製した前骨芽細胞から膜画分を抽出し、BMP receptorⅠa及びⅡ(BMPRⅠa, BMPRⅡ)の膜発現量を調べたところ、各レセプターにおいて、WTとKOで発現量に有意差はなかった。次に、前骨芽細胞にBMP4を加えSmad1/5/8のC末側リン酸化動態について調べたところ、KOではWTに比べてリン酸化がピークに達するまでに時間がかかる一方、リン酸化状態が持続した。また、Smad1のリンカー領域のリン酸化についても調べたが、WTとKOで有意差はなかった。我々は最近、PRIPがprotein phosphatase (PP) 2Aと結合して、分子のリン酸化脱リン酸化を調節していることを見いだした。PP2AはSmadのC末の脱リン酸化にも働いており、今回の結果でPRIP-KOマウスにおいてSmad1 C末のリン酸化動態に差が見られたことから、PRIPがPP2Aを介してその脱リン酸化調節に関わると考えられた。

開催年月日： 2011年12月

会議種別：シンポジウム・ワークショップ パネル（公募）  

開催地：横浜   国名：日本国  

PRIP (PLC-Related, but catalytically Inactive Protein) は、Ins(1,4,5)P3 結合性の分子として見いだされた新規分子であり、種を越えて広く存在するタンパク質である。２つのサブタイプが存在し、PRIP-1は脳に多く発現しているのに対し、PRIP-2は比較的ユビキタスな発現パターンを示す。我々は、PRIP-1及びPRIP-2のダブルノックアウトマウスを作製し、本変異マウスにおいて総出産仔数の減少、血中性腺刺激ホルモン量の増加などの表現型を見いだし、性周期制御にPRIPが強く関与することを明らかにした。排卵数を調べるため、PMSG（妊馬血清性ゴナドトロピン）、HCG（人絨毛生性腺刺激ホルモン）を用いた排卵誘発を行ったところ、変異型で激減していた。このことから、出産仔数の減少は、排卵後の授精や着床における異常によるものではなく、卵成熟を含めた排卵に至るまでの過程における異常によるものであることが示唆された。そこで、まず排卵前後における遺伝子発現の変化を検討するために、卵巣RNAを用いたマイクロアレイ解析を行った。その結果、PMSG投与後48時間でHCGを投与した卵巣において、排卵前の卵胞で発現するHas2 (hyaluronan synthase 2)、Ptgs2 (cyclooxygenase 2)、PTX3 (pentraxin 3)、Tnfαip6 (TNFα-induced protein 6)などの発現量が、変異型で増加していた。また、同時期の卵巣の組織学的解析より、変異型において卵母細胞が残ったまま黄体化したような所見があり、これらのことから排卵時の制御におけるPRIPの関与が示唆された。そこで現在、野生型及び変異型マウスにおいて、排卵直前に起こる急激な変化（卵丘細胞-卵母細胞複合体のexpansionやヒアルロン酸の発現量及び局在等）について解析を進めている。

開催年月日： 2011年11月

会議種別：シンポジウム・ワークショップ パネル（公募）  

開催地：福岡   国名：日本国  

PRIP (phospholipase C-related, but catalytically inactive protein) is a novel protein isolated in this laboratory. PRIP-deficient mice showed increased serum gonadotropins, but decreased sex steroid hormones. This imbalance was similar to that for the cause of bone disease, such as osteoporosis. In the present study, therefore, we analyzed the bone property of mutant mice. We first performed three-dimensional analysis of 6,12-month old mice. The bone mineral density and trabecular bone volume were higher in mutant mice. We further performed histomorphometrical assay of bone formation parameters of 8-weeks mice: bone formation rate, mineral apposition, osteoid thickness, and osteoblast number were up-regulated in the mutant, indicating that increased bone mass is caused by the enhancement of bone formation ability. We then cultured primary cells isolated from calvaria prepared from both genotypes. In mutant mice, osteoblast differentiation, as assessed by alkaline phosphatase activity and the expression of osteoblast differentiation marker genes, was enhanced. Moreover, the analysis of the phosphorylation of Smad1/5/8 in response to bone morphogenic protein (BMP) showed the longer phosphorylation in the mutant. These results indicate that PRIP is implicated in the negative regulation of bone formation. Now, we are analyzing the function of PRIP in the regulation of bone formation using a mouse myoblastic cell line, C2C12, which is induced to differentiate into the osteoblast linage by BMP. PRIP is expressed in also C2C12 cells, and we are in generating the stable cell lines of knockdown or overexpression of PRIP in C2C12 cells to investigate the regulation of BMP signaling in the presence or absence of PRIP.

開催年月日： 2011年9月 - 2011年10月

会議種別：口頭発表（一般）  

開催地：長良川国際会議場   国名：日本国  

【目的】PRIPは当研究室で見いだされたシグナリング分子である。この遺伝子欠損マウス(PRIP-KOマウス)は、生殖に関連するホルモンの分泌異常を示した。その異常は閉経後骨粗鬆症に見られるホルモン・アンバランスに類似していたため、PRIP-KOマウスの骨組織の解析を行った。【方法・結果】骨の状態を把握する為に、６,１２ヶ月齢の大腿骨を３次元計測したところ、PRIP-KOマウスでは骨密度及び海綿骨の骨量が増加していた。この増加は、卵巣摘出マウスの作製・解析の結果、ホルモンの影響によらないことが示唆された。次に、８週齢の大腿骨の形態計測を行ったところ、PRIP-KOマウスでは骨形成パラメーターの亢進が見られた。更に、骨芽細胞の初代培養を用いた解析にて、PRIP-KOマウスでは骨芽細胞の分化能が高く、骨形成の転写因子Smadのリン酸化レベルの延長が認められた。また、破骨細胞の初代培養を用いた解析にて、骨吸収能の低下やactin ringを持つ破骨細胞数の減少が認められた。【考察】PRIP-KOマウスでは野生型に比べ、骨形成が促進し骨吸収が抑制されていると考えられた。また、この現象はホルモンの直接的な影響を受けていないことが示唆された。更に、初代培養において骨芽細胞への分化能が亢進していたことから、PRIPが骨代謝に関与していることが示唆された。

開催年月日： 2011年9月 - 2011年10月

会議種別：シンポジウム・ワークショップ パネル（公募）  

開催地：長良川国際会議場   国名：日本国  

開催年月日： 2011年9月

会議種別：シンポジウム・ワークショップ パネル（公募）  

開催地：京都   国名：日本国  

RIPは当研究室で見いだされた新規のシグナリング分子である。この遺伝子欠損マウス(PRIP-KO マウス)は、性腺刺激ホルモンや性ステロイドホルモンの分泌異常を示した。この異常は閉経後女性などに見られるホルモン・アンバランスに類似し、ホルモン・アンバランスは骨粗鬆症などの骨疾患の一因と考えられている。そこで我々は、PRIP-KO マウスの骨について多面的に解析を始めた。6、12ヶ月齢の大腿骨の3次元計測及び8週齢の大腿骨の形態計測から、PRIP-KO マウスの骨形成の亢進及び骨形成パラメーターの亢進が認められ、卵巣摘出マウスの大腿骨の3次元計測から、PRIP-KOマウスにおける骨量増加はホルモンの影響によらないことが示唆された。そこで、PRIPが骨形成制御に関与しているのではないかと考え、まず骨芽細胞及び破骨細胞におけるPRIPの発現をウエスタンブロッティングにて確認した。次に、骨芽細胞の初代培養を用いて分化誘導実験を行ったところ、野生型に比べPRIP-KOマウスにおいて骨芽細胞の分化能が高いことが示された。そこで、骨芽細胞への分化を制御するシグナリングにPRIPが関わっているのではないかと考え、Smad1/5/8のリン酸化について調べた。PRIP-KOマウスでは野生型に比べてリン酸化がピークに達するまでの時間が長くなる一方、リン酸化状態がより持続した。さらに解析を進めるために、培養細胞の系を用いることとして、BMP刺激で骨芽細胞への分化が可能なマウス筋芽細胞系由来の細胞株C2C12についてPRIPの有無をウエスタンブロッティングにて確認したところ発現が認められたので、この細胞株を用いて解析を進めることにした。これまでの結果から、PRIPは骨芽細胞分化に関わるシグナリングに関与することで、骨形成の制御に機能することが示唆された。現在、C2C12を用いてPRIPを発現抑制及び過剰発現した細胞株を構築中である。

開催年月日： 2011年7月

会議種別：口頭発表（一般）  

開催地：福岡   国名：日本国  

【目的】PRIPは当研究室で見いだされたシグナリング分子である。この遺伝子欠損マウス(PRIP-KOマウス)は、生殖に関連するホルモンの分泌異常を示した。その異常は閉経後骨粗鬆症に見られるホルモン・アンバランスに類似していたため、PRIP-KOマウスの骨組織の解析を行った。【方法・結果】骨の状態を把握する為に、６,１２ヶ月齢の大腿骨を３次元計測したところ、PRIP-KOマウスでは骨密度及び海綿骨の骨量が増加していた。この増加は、卵巣摘出マウスの作製・解析の結果、ホルモンの影響によらないことが示唆された。次に、８週齢の大腿骨の形態計測を行ったところ、PRIP-KOマウスでは骨形成パラメーターの亢進が見られた。更に、骨芽細胞の初代培養を用いた解析にて、PRIP-KOマウスでは骨芽細胞の分化能が高く、骨形成の転写因子Smadのリン酸化レベルの延長が認められた。また、破骨細胞の初代培養を用いた解析にて、骨吸収能の低下やactin ringを持つ破骨細胞数の減少が認められた。【考察】PRIP-KOマウスでは野生型に比べ、骨形成が促進し骨吸収が抑制されていると考えられた。また、この現象はホルモンの直接的な影響を受けていないことが示唆された。更に、初代培養において骨芽細胞への分化能が亢進していたことから、PRIPが骨代謝においてカップリングファクターとして関与していることが示唆された。

開催年月日： 2011年3月

会議種別：口頭発表（一般）  

開催地：福岡   国名：日本国  

We isolated a novel protein as an inositol 1,4,5-triphosphate binding protein molecule similar to phospholipase C, but catalytically inactive, then we termed it PRIP (PLC-related catalytically inactive protein). We found that PRIP binds GABARAP (GABA receptor associated protein)、regulating the membrane trafficking of GABAA receptor. Recently it was reported that GABARAP family are involved in autophagy. Therefore, we studied the possible involvement of PRIP in autophagy. Autophagy is a mechanism for the degradation of cellular material either as a way to provide nutrients during times of starvation or as a quality control mechanism that eliminates unneeded proteins and/or organelles during normal growth and development. Of 34 autophagy-related proteins (ATG) identified so far, ATG8 (LC3 in mammal) is used as a specific marker to monitor the process of autophagy. ATG8/LC3 is a member of GABARAP family. We first confirmed the interaction of PRIP with GABARAP family. PRIP interacted with GABARAP, and also with LC3 and other GABARAP family molecules, albeit to a lesser extent. Immunoprecipitation assay showed that PRIP interacted with both LC3-I (cytosolic form) and LC3-II (membrane bound form). Secondly, autophagy activities were monitored by Western blotting analysis using lysates obtained from wild-type (WT) and PRIP-deficient (PRIP-KO) mouse embryonic fibroblast (MEF) starved by amino acid-deprivation along with lysosomal inhibitors. The ratio of LC3-II/LC3-I was higher, and degradation of LC3-II (Autophagic flux) was more increased in PRIP-KO MEF. Thirdly, we generated WT and PRIP-KO mice, expressing transgene of GFP-LC3 by mating and prepared MEF from the mice. Enhanced autophagic activity, as assessed by more GFP dots observed under a confocal microscopy, was observed in the PRIP-KO MEF. Finally, PRIP gene was transfected to PRIP-KO MEF. The number of GFP dots was decreased in an inverse proportion to the expression level of PRIP. These results suggest that PRIP defieciency induces more autophagy, thus indicating that PRIP plays a negative role in autophagy, probably by interacting with LC3.

開催年月日： 2011年3月

会議種別：口頭発表（一般）  

開催地：福岡   国名：日本国  

PRIP (phospholipase C-related, but catalytically inactive protein) is a signaling protein isolated as an inositol 1,4,5-trisphoshpate binding protein. PRIP has a domain organization similar to phospholipase C-δ but lacking the enzyme activity. PRIP-deficient mice (PRIP-KO) mice showed an increased gonadotropin, but a decreased sex steroid hormone. The difference was similar to that for the cause of bone disease, such as osteoporosis. In the present study, therefore, we analyzed PRIP-KO mice with a special reference to the bone condition. We first performed three dimensional analysis of the femur of female mice. The bone mineral density and trabecular bone volume was higher in the mutant mice. We further performed histomorphometrical assay of bone formation parameters: bone formation rate, mineral apposition rate, osteoid thickness and osteoblast number were increased in the mutant, indicating that the increased bone mass is caused by the enhancement of bone formation ability. We then performed the primary culture of calvaria prepared from both genotypes. In cultures from the mutant mice, osteoblast differentiation was accelerated as assessed by the differentiation marker gene expression including alkaline phosphatase, runx2, osteonectin etc. Phosphorylation of Smad1/5/8 in response to BMP4 lasted longer, probably causing the increased expression of osteoblast differentiation markers. These results indicate that PRIP is involved in the negative regulation of the bone formation.

開催年月日： 2010年12月

会議種別：シンポジウム・ワークショップ パネル（公募）  

開催地：横浜   国名：日本国  

開催年月日： 2010年11月

会議種別：シンポジウム・ワークショップ パネル（公募）  

国名：アメリカ合衆国  

開催年月日： 2010年11月

会議種別：シンポジウム・ワークショップ パネル（公募）  

国名：日本国  

開催年月日： 2010年10月

会議種別：シンポジウム・ワークショップ パネル（公募）  

開催地：神戸   国名：日本国  

開催年月日： 2010年10月

会議種別：口頭発表（一般）  

開催地：神戸   国名：日本国  

開催年月日： 2010年9月 - 2010年10月

会議種別：シンポジウム・ワークショップ パネル（公募）  

開催地：メルボルン   国名：オーストラリア連邦  

PRIP (phospholipase C-related, but catalytically inactive protein) is a novel signaling protein isolated in this laboratory. PRIP-deficient mice (PRIP-KO) mice showed an increased gonadotropine, but a decreased sex steroid hormone. The difference was similar to that for the cause of bone disease, such as osteoporosis. In the present study, therefore, we analyzed bone condition of PRIP-KO mice. We first performed three dimensional analysis of the femur of female mice. The bone mineral density and trabecular bone volume was higher in the mutant mice. We further performed histomorphometrical assay of bone formation parameters: bone formation rate, mineral apposition rate, osteoid thickness and osteoblast number were accelerated in the mutant, indicating that the increased bone mass is caused by the enhancement of bone formation ability. We then performed the primary culture of calvaria prepared from both genotypes. In the mutant mice, osteoblast differentiation as assessed by alkaline phosphatase activity was accelerated. These results indicat that PRIP is implicated in the regulation of the bone formation.

開催年月日： 2010年9月 - 2010年10月

会議種別：シンポジウム・ワークショップ パネル（公募）  

開催地：メルボルン   国名：オーストラリア連邦  

It has been believed that P2X1 channels are predominantly and functionally expressed in smooth muscle cells, and are regulated by ATP and UTP released from sympathetic and sensory nerve terminals and various cells surrounding smooth muscle cells in vasculature. However, we here confirmed that P2X5 is also expressed in addition to P2X1 and thus the channels are formed in a hetero-multimeric fashion in smooth muscle cells in rat aorta, cerebral artery and mesenteric artery. By RT-PCR and Western blot analysis, we confirmed high expression of P2X1, P2X4 and P2X5 channel molecules in arteries. P2X1 and P2X5 channels were localized in membrane fraction, while P2X4 were in cytosol separated by a centrifugation. We further examined immuno-precipitation of P2X1 together with P2X5 channels, indicating that the channels are formed in a heteromeric complex. We also examined native P2X receptor function using patch-clamp method, and found that the current profiles evoked by ATP was similar to those from recombinant heteromeric P2X1/5 channels reported before. Taken together, our results suggest that P2X1/5-like channels functionally exist in rat aorta, cerebral artery and mesenteric artery, and may change their physiological function.

開催年月日： 2010年9月 - 2010年10月

会議種別：シンポジウム・ワークショップ パネル（公募）  

開催地：メルボルン   国名：オーストラリア連邦  

PAutophagy is an intracellular bulk degradation system, through which a portion of cytoplasm is delivered to lysosomes to be degraded under starvation and stress. Of 33 autophagy-related (ATG) proteins identified so far, ATG8 (MAP1LC3 in mammal) is used as a specific marker to monitor autophagy. We isolated a novel protein as an inositol 1,4,5-triphosphate binding protein molecule similar to phospholipase C, but catalytically inactive, then we termed it PRIP (PLC-related catalytically inactive protein). Later, we found that PRIP bound GABARAP (GABA receptor associated protein), a homologue of MAP1LC3. Therefore, we studied the possible involvement of PRIP in autophagy. We first confirmed the interaction between PRIP and MAP1LC3. PRIP had an interaction with not only GABARAP but also MAP1LC3. Then, autophagy activities were monitored by Western blotting analysis using lysates obtained from wild-type (WT) and PRIP- deficient (PRIP-KO) mouse embryonic fibroblast (MEF) starved by amino acid-deprivation. The level of LC3-II, a lipidation form of MAP1LC3, was more increased in PRIP-KO MEF. Furthermore, we generated WT and PRIP-KO mice, expressing transgene of GFP-LC3 by mating and prepared the MEF. Enhanced autophagic activity, as assessed by more GFP-LC3 puncta observed under a confocal microscopy, was observed in the PRIP-KO GFP-LC3 MEF. These results suggest that PRIP plays a nagative role in autophagy.

開催年月日： 2010年9月

会議種別：口頭発表（一般）  

開催地：東京   国名：日本国  

開催年月日： 2010年9月

会議種別：口頭発表（一般）  

開催地：東京   国名：日本国  

PRIP (phospholipase C-related, but catalytically inactive protein) is a novel signaling protein isolated in this laboratory. PRIP-deficient mice (PRIP-KO) mice showed an increased gonadotropine, but a decreased sex steroid hormone. The difference was similar to that for the cause of bone disease, such as osteoporosis. In the present study, therefore, we analyzed bone condition of PRIP-KO mice. We first performed three dimensional analysis of the femur of female mice. The bone mineral density and trabecular bone volume was higher in the mutant mice. We further performed histomorphometrical assay of bone formation parameters: bone formation rate, mineral apposition rate, osteoid thickness and osteoblast number were accelerated in the mutant, indicating that the increased bone mass is caused by the enhancement of bone formation ability. We then performed the primary culture of calvaria prepared from both genotypes. In the mutant mice, osteoblast differentiation as assessed by alkaline phosphatase activity was accelerated. These results indicat that PRIP is implicated in the regulation of the bone formation.

開催年月日： 2010年7月

会議種別：口頭発表（一般）  

開催地：福岡   国名：日本国  

【目的】PRIPは当研究室で見いだされた新規のシグナリング分子である。この遺伝子欠損マウス(PRIP-KO マウス)は、性腺刺激ホルモンや性ステロイドホルモンの分泌異常を示した。この異常は閉経後女性などに見られるホルモン・アンバランスに類似しており、骨粗鬆症といった骨疾患の起因になると言われている。そこで我々は、PRIP-KO マウスの骨組織について多面的に解析した。 【方法・結果】骨の状態を把握するために、６、１２ヶ月齢の大腿骨を pQCT 及びμCTを用いて３次元計測したところ、PRIP-KO マウスでは骨密度が増加し、海綿骨の骨量や骨梁の幅、単位長あたりの骨梁数が増加していた。そこで、これらの増加がホルモンの影響によるものかを調べるために、卵巣摘出マウスモデルを作製し、大腿骨の３次元計測を行ったところ、PRIP-KOマウスにおける骨量増加はホルモンの影響によらないことが示唆された。次に、８週齢のメスの野生型および PRIP-KO マウスより調製した大腿骨の骨組織形態計測を行ったところ、野生型に比べPRIP-KO マウスでは骨形成パラメーターの亢進が認められた。さらに、骨形成に関与する骨芽細胞の初代培養を用いて解析を行なったところPRIP-KOマウスにおいて骨芽細胞の分化能が高いことが示された。 【考察】PRIP-KO マウスでは野生型に比べ、骨形成パラメーターの亢進、骨密度や海綿骨の骨量の増加から、骨形成が促進していると考えられた。また、この現象はホルモンの直接的な影響を受けないことが示唆された。更に、骨芽細胞の初代培養による結果を鑑みると、PRIPが骨形成の制御に関与していることが示唆された。

開催年月日： 2010年7月

会議種別：シンポジウム・ワークショップ パネル（公募）  

国名：アメリカ合衆国  

開催年月日： 2010年5月

会議種別：口頭発表（一般）  

開催地：鹿児島   国名：日本国  

開催年月日： 2010年5月

会議種別：口頭発表（一般）  

開催地：鹿児島   国名：日本国  

開催年月日： 2010年2月

会議種別：口頭発表（一般）  

開催地：福岡   国名：日本国  

Phospholipase C-related but catalytically inactive protein (comprising PRIP-1 and -2) has been isolated as a novel inositol 1,4,5-trisphosphate binding protein with a domain organization similar to phospholipase C-delta but lacking the emzyme activity. We have recently reported that PRIP-1 and –2 double knockout (DKO) mice showed upregulation of gonadotropin secretion, but lower levels of serum sex steroid hormones were observed. Therefore we analyzed the bone condition of PRIP-DKO mice and the results indicated the involvement of PRIP in the regulation of bone metabolism. The PRIP-1 gene is expressed predominantly in the brain, while PRIP-2 exhibits a relatively ubiquitous expression. We speculated that the expression of PRIP-1 in brain is important for the regulation of hormone balance because central nervous system is involved in the regulation of many of hormones secretions. In this study, we investigated PRIP-1 gene structure and the possible mechanisms involved in the expression. The tissue distribution pattern of PRIP gene expression in humans was similar to that in rodents. 5’RACE (rapid amplification of cDNA ends) analysis using PRIP-1 gene specific primers with human brain mRNA revealed the presence of three new exons, indicating that the PRIP-1 gene is organized into 8 exons intervened by 7 introns. Although three transcripts resulting from the alternative splicing of exon 2 and/or 3 were detected, a transcript lacking exons 2 and 3 was predominantly expressed in humans, suggesting that the translation start codon of human PRIP-1 exists in exon 1. To characterize the human PRIP-1 promoter, transient luciferase assay was carried out. The results indicated that the positive regulatory region is located –237 to –108 bp upstream from the transcription start site. Gel shift assay revealed the specific binding of some nuclear proteins to this region, suggesting that the existence of transcription factors contributes to the positive regulation of PRIP- 1 gene expression. Mutation analyses revealed that the binding of a transcription factor, MAZ to the regulatory site leads to the promoter activity, indicating that MAZ is involved in the expression regulation of the human PRIP-1 gene.

開催年月日： 2009年11月

会議種別：口頭発表（一般）  

開催地：佐世保   国名：日本国  

P2X receptors are non-selective cation channels gated by extracellular ATP, and play important roles in various physiological processes. It is well documented that ATP is released from sympathetic and sensory nerve terminals and various cells surrounding smooth muscle cells in vasculature. UTP is also released from these cells. It has been generally considered that UTP regulates vascular tone through selective activation of G-protein coupled P2Y receptors. However, we here confirmed that UTP mediates contraction of vascular smooth muscle through P2X receptor activation. Using RT-PCR and Western blot analysis, we have detected high expression of P2X1 subtype in cerebral and mesenteric arteries and aorta. P2Y2, 4, and 6 receptors were also detected by RT-PCR. Next, we examined native P2X receptor function using patch-clamp method. Application of UTP (≥10μM) induced transient inward current in arterial　(cerebral or mesenteric and aortic) smooth muscle cells. The current showed inward-rectification, which was similar to those evoked by activation of P2X channel. The UTP-induced current was inhibited by several P2X and P2 receptor antagonists, TNP-ATP, suramin and PPADS. Application of α,β-methylene ATP (10μM), a potent P2X receptor agonist, slightly potentiated the UTP (1mM) -evoked current, but inversely, application of UTP (1mM) did not facilitate the α,β-methylene ATP (10μM) -evoked current. Moreover, application of α,β-methylene ATP (10μM) little facilitated the UTP (3mM) –evoked current. These results indicate that UTP activates the same receptor which is sensitive to α,β-methylene ATP. We also performed a tension recording with a rat aortic ring preparation denuded of endothelium. UTP elicited a biphasic contraction consisting of phasic and tonic components. The phasic contraction disappeared when application of Ca2+-free solution and nifedipine, a specific blocker for L-type voltage-operated calcium channel, whereas the tonic contraction remained. Taken together, our results suggest that UTP regulate the arterial tone through P2X1-like and P2Y receptors activation.

開催年月日： 2009年11月

会議種別：口頭発表（一般）  

開催地：佐世保   国名：日本国  

Phospholipase C-related but catalytically inactive protein (comprising PRIP-1 and -2) was first identified as a novel D-myo-inositol 1,4,5-trisphosphate [Ins(1,4,5)P3] binding protein, but the biological functions have remained elusive. We therefore generated PRIP-1 and –2 double knockout (DKO) mice to gain insight into the biological function. DKO mice apparently grew normally and became fertile; however, during animal maintenance, we noticed that mutant couples exhibited decreased litter events and litter size, indicating dysfunction of the reproductive system. To discriminate whether males or females were defective, cross-mating experiments were performed and indicated that the cause appeared to be on the female side. Mutant female mice had an apparently smaller uterus in gross anatomical observations of the reproductive organs. To further characterize the reproductive physiology of DKO mice, we examined the estrous cycle in mice by histological analysis of vaginal smears. DKO females showed cyclic estrus as wild-type mice, but the estrous days were apparently increased in DKO mice. Levels of serum LH and FSH were measured for 5-6 consecutive days, and were significantly higher in the mutant, which was also confirmed by examining the secretion of LH from the explant culture of anterior pituitary glands of wild-type and DKO mice. We also examined the ability of the ovaries in response to gonadotropins: the total number of the ovulated oocytes were significantly decreased in mutant female mice, compared to that seen with wild-type, which was also confirmed by histological analysis of the ovaries after ovulation. These results indicate that PRIP plays an important role in female reproductive system, possibly ovarian follicle maturation, through gonadotropin secretion.

開催年月日： 2009年11月

会議種別：口頭発表（一般）  

開催地：佐世保   国名：日本国  

Phospholipase C-related catalytically inactive protein (PRIP) deficient mice (PRIP-KO mice) showed upregulation of gonadotropin secretion, but lower levels of serum sex steroid hormones were observed. These hormonal imbalances are well-known to cause the malfunction of bone metabolism, leading to bone diseases including osteoporosis. In the present study, therefore, we analyzed PRIP-KO mice regarding to the bone condition. We performed tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) staining for the osteoclasts in the femurs of the female mice and the increased number of osteolcast was observed in the mutant mice. Also TRAP staining analysis of primary osteoclast-like cells from bone marrow macrophages showed more induced osteoclast-like cells in the mutant cultures than those in the wild type, as suggested from the gonadotropin/steroid hormone imbalance. However, trabecular bone masses in the mutant mice were apparently increased, as assessed by peripheral quantitative computed tomography (pQCT) and micro-computed tomography (μCT). To measure bone formation ability, we performed double calcein labels on the femurs of the female mice. In the mutant femurs, bone formation rate with bone surface (BFR/BS) was significantly higher, and the number of osteoblasts was increased. These results suggested that PRIP participates in the bone formation. The mechanisms underlying the observation are currently investigated.

開催年月日： 2009年11月

会議種別：シンポジウム・ワークショップ パネル（公募）  

開催地：Orlando   国名：アメリカ合衆国  

Background: ATP is one of important vasoactive substances and is released from sympathetic nerve terminal, endothelial cells and other cells surrounding smooth muscle cells. Ionotropic P2X channel is one of the representative receptors, and only homomeric P2X1 has been thought to be the functional molecular architecture in vascular smooth muscle cells for a long time. However, some inconsistencies exist between native P2X1-like and cloned P2X1 channels. Methods: Male rats aged 10 –11w were used. P2X channel current was measured in smooth muscle cells isolated from aorta, cerebral or mesenteric artery using patch-clamp technique. RT-PCR and Western blot analyses were employed for detecting their messenger RNAs and proteins, and their interaction in combination with an immunoprecipitation method. Results: Application of ATP ( 100nM) elicited dual phase, fast and slow, desensitizing inward current by whole cell recording. The ATP-induced current also showed rebound current, which is a typical feature specific to cloned P2X1/5 channel. I-V relationship of the current was that of inward-rectifying, and reversal potential was around 0mV, close to the equivalent potential of non-selective cation channel in spite of various intracellular chloride ion concentration. Sensitivity of several ATP analogs is as follows; 2-methylthio ATP>BzATP>ATP> , β-methylene ATP>ATP S. The channel conductance was 10.5±0.1pS by a single channel recording. The current was blocked by several P2X and P2 receptor antagonists, TNP-ATP, suramin and PPADS, and their 50% inhibitory concentrations (IC50) were similar to those of cloned P2X1/5 channel (1.0, 0.5 and 0.6µM, respectively; n=3~5). RT-PCR and Western blot analysis revealed highly expression of both P2X1 and P2X5 channels in extracts from arteries examined, and both channel proteins were found to be complexed as assessed by an immunoprecipitation method. Conclusion: Our results indicate that hetero-multimeric P2X1/5 channel, but not only P2X1, is functionally expressed in arterial smooth muscle, and may play an important role in vascular tone regulation.

開催年月日： 2009年9月

会議種別：シンポジウム・ワークショップ パネル（公募）  

開催地：新潟   国名：日本国  

PRIP (phospholipase C-related, but catalytically inactive protein) is a novel signaling protein isolated in this laboratory. PRIP-deficient mice (PRIP-KO) mice showed an increased gonadotropine, but a decreased sex steroid hormone. The difference was similar to that for the cause of bone disease, such as osteoporosis. In the present study, therefore, we analyzed bone condition of PRIP-KO mice. We first performed three dimensional analysis of the femur of female mice. The bone mineral density and trabecular bone volume was higher in the mutant mice. We further performed histomorphometrical assay of bone formation parameters: bone formation rate, mineral apposition rate, osteoid thickness and osteoblast number were accelerated in the mutant, indicating that the increased bone mass is caused by the enhancement of bone formation ability. We then performed the primary culture of calvaria prepared from both genotypes. In the mutant mice, osteoblast differentiation as assessed by alkaline phosphatase activity was accelerated. These results indicat that PRIP is implicated in the regulation of the bone formation.

開催年月日： 2009年8月

会議種別：シンポジウム・ワークショップ パネル（公募）  

開催地：上海   国名：中華人民共和国  

It has been believed that P2X1 channels are predominantly and functionally expressed in smooth muscle cells, and are regulated by ATP and UTP released from sympathetic and sensory nerve terminals and various cells surrounding smooth muscle cells in vasculature. However, we here confirmed that P2X5 is also expressed in addition to P2X1 and thus the channels are formed in a hetero-multimeric fashion in smooth muscle cells in rat aorta, cerebral artery and mesenteric artery. By RT-PCR and Western blot analysis, we confirmed high expression of P2X1, P2X4 and P2X5 channel molecules in arteries. P2X1 and P2X5 channels were localized in membrane fraction, while P2X4 were in cytosol separated by a centrifugation. We further examined immuno-precipitation of P2X1 together with P2X5 channels, indicating that the channels are formed in a heteromeric complex. We also examined native P2X receptor function using patch-clamp method, and found that the current profiles evoked by ATP was similar to those from recombinant heteromeric P2X1/5 channels reported before. Taken together, our results suggest that P2X1/5-like channels functionally exist in rat aorta, cerebral artery and mesenteric artery, and may change their physiological function.

開催年月日： 2009年8月

会議種別：シンポジウム・ワークショップ パネル（公募）  

開催地：上海   国名：中華人民共和国  

Phospholipase C-related but catalytically inactive protein (comprising PRIP-1 and -2) was first identified as a novel inositol 1,4,5-trisphosphate binding protein, but the biological functions have remained elusive. We therefore generated PRIP-1 and –2 double knockout (DKO) mice to gain insight into the biological function. DKO mice grew normally and became fertile. However, during animal maintenance, we noticed that mutant couples exhibited decreased litter occasion and litter size, indicating dysfunction of the reproductive system. Cross-mating experiments, to discriminate whether males or females were defective, indicated that the cause appeared to be on the female side. Mutant female mice had an apparently smaller uterus by gross anatomical observation, and had more estrous days during the cycles. Basal levels of serum LH and FSH were significantly higher in the mutant, the event of which was also confirmed by examining the secretion from the tissue culture of anterior pituitary glands. We also examined the ability of the ovaries in response to gonadotropins: the total number of the ovulated oocytes were significantly decreased in mutant female mice, compared to that seen with wild-type. These results indicate that PRIP plays an important role in female reproductive system, possibly ovulation event, through gonadotropin secretion.

開催年月日： 2009年8月

会議種別：シンポジウム・ワークショップ パネル（公募）  

開催地：上海   国名：中華人民共和国  

PPRIP deficit mice (PRIP-KO mice) showed upregulation of gonadotropin secretion, but lower levels of serum sex steroid hormones were observed. These hormonal imbalances are well-known to cause the malfunction of bone metabolism, leading to bone diseases including osteoporosis. In the present study, therefore, we analyzed PRIP-KO mice regarding to the bone condition. We first performed tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) staining for the osteoclasts in the femurs of the female mice. In the mutant mice, the number of osteoclasts was increased compared to that in the control mice, as suggested from the gonadotropine/steroid hormone imbalance. However, trabecular bone masses in the mutant mice were apparently increased, as assessed by histomorphometrical analysis. The number of osteoblasts was also increased in the mutant mice. We further performed bone marrow culture in the presence of macrophage colony stimulating factor (M-CSF) and receptor activator of nuclear factor kappa B-ligand (RANKL). The osteoclast-like cells as assessed by TRAP staining were more induced in the mutant cultures than those in the wild type. These results indicate that PRIP is implicated in the regulation of the bone metabolism．The mechanisms underlying the observation are currently investigated.

開催年月日： 2009年5月

会議種別：口頭発表（一般）  

開催地：福岡   国名：日本国  

開催年月日： 2009年5月

会議種別：口頭発表（一般）  

開催地：福岡   国名：日本国  

開催年月日： 2009年5月

会議種別：口頭発表（一般）  

開催地：福岡   国名：日本国  

開催年月日： 2008年12月

会議種別：シンポジウム・ワークショップ パネル（公募）  

開催地：神戸   国名：日本国  

PRIP (phospholipase C related, but catalytically inactive protein) was identified as a novel inositol 1,4,5-trisphosphate binding protein, whose domain organization is similar to that of phospholipase C-_1 but is catalytically inactive, comprizing two isoforms, PRIP-1 and PRIP-2. To get insight into the biological functions, we generated the double knockout (DKO) mice of both PRIP-1 and PRIPミ2, followed by the phenotypic analyses. DKO mice grew normally and became fertile. However DKO female exhibited the decreased litter occasion and litter size, indicating the dysfunction of female reproductive system. Then we examined the estrus cycle by cytological analysis of daily vaginal smears, resulting in the irregular cycle in DKO mice. We further noticed that the mutant mice had apparently smaller sized uterus by gross anatomical observation. Basal levels of serum leuteinizing hormone and follicle stimulating hormone were significantly higher in the mutant, the event of which was also confirmed by examining the secretion from the tissue culture of anterior pituitary glands. These results suggest that PRIP is involved in maternal reproduction, through the gonadotropine secretion.

開催年月日： 2008年12月

会議種別：シンポジウム・ワークショップ パネル（公募）  

開催地：神戸   国名：日本国  

会議種別：シンポジウム・ワークショップ パネル（公募）  

開催地：神戸ポートアイランド   国名：日本国  

Calcitonin (CT), whose secretion from thyroid glands is regulated by changes in the concentration of extracellular and intracellular calcium, is a well-known polypeptide hormone to regulate calcium homeostasis. However the molecular mechanism regarding the gene expression has remained to be clarified. We speculated that calcitonin gene expression will be regulated by a certain transcription factor which binds Ca2+, because the secretion of calcitonin is regulated by Ca2+ concentration strictly. And we analyzed about this.

会議種別：口頭発表（一般）  

開催地：POSTECH biotech center   国名：大韓民国  

Calcitonin (CT), whose secretion from thyroid glands is regulated by changes in the concentration of extracellular and intracellular calcium, is a well-known polypeptide hormone to regulate calcium homeostasis. However the molecular mechanism regarding the gene expression has remained to be clarified. Recently, a transcriptional repressor, downstream regulatory element antagonist modulator (DREAM) was identified. We speculated that DREAM is involved in the transcriptional regulation of CT, because DREAM binds to downstream regulatory element (DRE) and upon the increased intracellular Ca2+ concentration, it detaches from the DRE to release the repression. In this study, we investigated the involvement of DREAM in the regulation of the gene expression of CT and following secretion processes. By reverse transcriptional polymerase chain reaction (RT-PCR) and electrophoretic mobility shift assay (EMSA), we found the presence of endogenous DREAM in TT cells which are medullary thyroid carcinoma cell line and secret CT. We isolated DREAM cDNA and constructed the dominant negative DREAM with the mutations in the fourth EF-hand, lacking the responsiveness to the changes in Ca2+ concentration. Then we generated stable transfectants of TT cells by the transfection of wild type or mutant DREAM gene. In contrast to the wild type, overexpression of mutant DREAM lacking a functional EF hand inhibited the secretion of CT, induced by A23187, a calcium ionophore. Furthermore, we found that TT cells, transfected with antisense DREAM, increase the secretion of CT by A23187. EMSA also indicated that DREAM binds to the DRE sequence in the promoter region of CT gene. These results indicate that DREAM plays important roles in the regulation of CT gene transcription and the secretion.

会議種別：口頭発表（一般）  

開催地：POSTECH biotech center   国名：大韓民国  

会議種別：シンポジウム・ワークショップ パネル（公募）  

開催地：福岡   国名：日本国  

The PRIP [phospholipase C (PLC) related, but catalytically inactive protein] family has been isolated as a novel inositol 1,4,5-trisphosphate binding protein with a domain organization similar to phospholipase C-d but lacking PLC activity, comprising PRIP-1 and PRIP-2. The PRIP-1 gene is expressed predominantly in the brain, while PRIP-2 exhibits a relatively ubiquitous expression in rats and mice. We also found that PRIP-1 plays an important role in type A receptor signaling for g-aminobutyric acid in the brain. In this study, we investigated PRIP-1 gene structure and the possible mechanisms involved in the expression. The tissue distribution pattern of PRIP gene expression in humans was similar as that in rodents. 5ユRACE (rapid amplification of cDNA ends) analysis using PRIP-1 gene specific primers with human brain mRNA revealed the presence of three new exons, indicating that the PRIP-1 gene is organized into 8 exons intervened by 7 introns. Although three transcripts resulting from the alternative splicing of exon 2 and/or 3 were detected, a transcript lacking exons 2 and 3 was predominantly expressed in humans, suggesting that the translation start codon of human PRIP-1 exists in exon 1. To characterize the human PRIP-1 promoter, transient luciferase assay was carried out with luciferase constructs including various lengths of the 5ユflanking region of the PRIP-1 gene. The results indicated that the positive regulatory region is located -237 to -107 bp upstream from the transcription start site. Gel shift assay revealed the specific binding of some nuclear proteins to this region, suggesting that the existence of transcription factors contributes to the positive regulation of PRIP-1 gene expression. Mutation analyses revealed that the binding of a transcription factor, MAZ to the regulatory site leads to the promoter activity, indicating that MAZ is involved in the expression regulation of the human PRIP-1 gene.

会議種別：シンポジウム・ワークショップ パネル（公募）  

開催地：Kyoto   国名：日本国  

Calcitonin (CT), whose secretion from thyroid glands is regulated by increases in the concentration of extracellular Ca2+, is a well-known hormone to regulate calcium homeostasis. However, the molecular mechanisms underlying the gene expression dependent on Ca2+ have not been clarified. The downstream regulatory element (DRE) antagonist modulator (DREAM) was recently identified as a Ca2+-dependent transcriptional repressor. We investigated the possible involvement of DREAM in the regulation of CT gene expression and secretion. Luciferase assay using TT cells, a thyroid carcinoma cell line, showed that a particular region in the CT gene promoter repressed the promoter activity under basal conditions, but induced the activity when the Ca2+ concentration was increased. We found two DRE core sequences in the upstream region from the transcription start site. Gel mobility shift assay confirmed the binding of DREAM to the CT-DRE and also indicated that DREAM bound to the DRE in a Ca2+ dependent manner. We generated stable transfectants of TT cells with wild type or mutant DREAM, which lacks the responsiveness to Ca2+ changes. In contrast to the wild type, overexpression of the mutant DREAM inhibited the increase in CT secretion induced by a calcium ionophore. The addition of forskolin to increase cAMP activated the CT promoter, probably by the interaction of DREAM with cAMP responsive element binding proteins, independent of the activation by Ca2+. Together, these results suggest that DREAM plays an important role in human CT gene expression in a Ca2+ and cAMP dependent manner.

開催地：Beiging   国名：中華人民共和国  

会議種別：シンポジウム・ワークショップ パネル（公募）  

開催地：Gyeongju   国名：大韓民国  

Calcitonin (CT), whose secretion from thyroid glands is regulated by increases in the concentration of extracellular Ca2+, is a well-known polypeptide hormone to regulate calcium homeostasis through the effects on target tissues such as bone and kidney. However, the molecular mechanisms underlying the gene expression dependent on Ca2+ have not been clarified. The downstream regulatory element (DRE) antagonist modulator (DREAM) was recently identified as a Ca2+-dependent transcriptional repressor. In this study, we have investigated the possible involvement of DREAM in the regulation of CT gene expression and secretion. Luciferase assay using TT cells, a thyroid carcinoma cell line, showed that a particular region in the CT gene promoter repressed the promoter activity under basal conditions, but induced the activity by the increase of Ca2+ concentration. We found two DRE core sequences in a region located upstream from the transcription start site of CT gene. Gel mobility shift assay confirmed the binding of DREAM to the CT-DRE and also indicated that DREAM bound to the DRE in a Ca2+ dependent manner. We generated stable transfectants of TT cells with wild type or mutant DREAM, which lacks the responsiveness to Ca2+ changes. In contrast to the wild type, overexpression of the mutant DREAM inhibited the increase in CT secretion induced by a calcium ionophore. The addition of forskolin to increase adenosine 3',5'-cyclic monophosphate (cAMP) activated the CT promoter, probably by the interaction of DREAM with cAMP responsive element binding proteins, independent of the activation by Ca2+. Together, these results suggest that DREAM plays an important role in human CT gene expression in a Ca2+ and cAMP dependent manner.

会議種別：口頭発表（一般）  

開催地：札幌   国名：日本国  

会議種別：シンポジウム・ワークショップ パネル（公募）  

開催地：横浜   国名：日本国  

会議種別：口頭発表（一般）  

開催地：横浜   国名：日本国  

The PRIP (phospholipase C related, but catalytically inactive protein, comprising type 1 and 2) was first isolated from rat brain as an inositol 1,4,5-trisphosphate binding protein with a domain organization similar to that of phospholipase C-d1 but lacking the enzyme activity. To get insight into the biological functions, we generated type 1 and 2 double knock-out (DKO) mice, followed by the phenotypic analyses. DKO mice were apparently normal and became fertile, but we noticed that DKO female mice exhibited the decreased litter occasion and the decreased number of pups per litter, indicating the dysfunction of female reproductive system. Then we analyzed the estrus cycle by histological examination of uterus vaginal smears, and the results indicated irregular cycle. We further knew that the mutant mice had apparently smaller sized uterus by the dissection. Serum levels of leuteinizing hormone and follicle stimulating hormone were robustly higher in the mutant mice. These results strongly suggest that PRIP is implicated in the function of female reproductive system.

記述言語：日本語  

記述言語：日本語  

記述言語：英語  

記述言語：日本語  

記述言語：日本語  

開催地：九州大学、福岡市   国名：日本国  

記述言語：英語   掲載種別：記事・総説・解説・論説等（学術雑誌）  

The role of different PI-PLC isoforms in cell signaling and control of various cellular functions has been extensively studied. Of the four families of PI-PLC, PLC-gamma family (PLC-gamma1 and PLC-gamma2) has been identified as an important component in pathways triggered by growth factor receptors in normal and cancer cells. Similarly, PLC-gamma isoforms have a crucial role in signaling in hematopoietic cells. Insights into molecular mechanisms of PLC-gamma activation provided a basis for the model suggesting two regulatory steps; the first step is related to translocation to the plasma membrane and the second step involves further changes resulting in high rate of substrate hydrolysis, presumably by overcoming intramolecular inhibition. Although the enzyme activity of PLC-gamma and other PI-PLC families can be inhibited by the compound U73122, there is a need for more specific inhibitors to assess further the signaling and mechanistic aspects of PLC-gamma function.

種別：大会・シンポジウム等 

参加者数：40

種別：大会・シンポジウム等 

参加者数：100

種別：大会・シンポジウム等 

種別：大会・シンポジウム等 

参加者数：200

種別：大会・シンポジウム等 

参加者数：50

種別：大会・シンポジウム等 

参加者数：50

種別：大会・シンポジウム等 

参加者数：100

種別：大会・シンポジウム等 

参加者数：200

種別：大会・シンポジウム等 

参加者数：100

種別：大会・シンポジウム等 

参加者数：100

種別：大会・シンポジウム等 

参加者数：100

先端歯学スクール２０１６　事務局代表

放課後、自主的に研究に参加する学部生への研究指導

先端歯学スクール２０１5　事務局代表

放課後、自主的に研究に参加する学部生への研究指導

放課後、自主的に研究に参加する学部生への研究指導

放課後、自主的に研究に参加する学部生への研究指導

放課後、自主的に研究に参加する学部生への研究指導

放課後、自主的に研究に参加する学部生への研究指導

放課後、自主的に研究に参加する学部生への研究指導

放課後、自主的に研究に参加する学部生への研究指導

放課後、自主的に研究に参加する学部生への研究指導。

対象：社会人・一般,　学術団体,　企業,　市民団体,　行政機関

種別：その他

骨は、体を支持する役割に加えてホルモン分泌を通して全身のエネルギー代謝を調節することで注目されています。骨形成（骨芽細胞の作用）と骨吸収（破骨細胞の作用）のバランスによって骨は維持されており、そのバランスが崩れると骨粗鬆症や大理石病などの骨疾患だけでなく生活習慣病など様々な代謝系疾患を引き起こすことが知られています。九州大学大学院歯学研究院口腔細胞工学分野の村上絢子研究員、松田美穂講師、平田雅人主幹教授（現福岡歯科大学客員教授）の研究グループは、自らが発見した分子、PRIP (Phospholipase C Related but Catalytically Inactive Protein) が骨の維持に重要な破骨細胞の作用に関わることを明らかにしました。この分子を持たないマウスを作ったら、骨量が増加していたのです。また、歯に矯正力をかけたら、対照（野生型）に比べて歯の移動が減少しました。そこで、歯の移動に重要な「骨吸収作用」を担う破骨細胞の作られ方（分化）を調べたところ、その分化が進んでいないことが分かりました。つまり、破骨細胞が適切に作られて骨を吸収するには、PRIPが必要であることを示したのです。その分子基盤の一端も明らかにしました。今回の報告で、骨を維持する機構の基盤研究に進展をもたらすものと期待されます。また、骨疾患だけでなく代謝系疾患の病因・病態の解明や治療の標的分子の発見につながる可能性があり、それらを通して超高齢社会におけるQOL向上にも貢献する手がかりとなるものと期待されます。

対象：社会人・一般,　学術団体,　企業,　市民団体,　行政機関

種別：その他

対象：社会人・一般,　学術団体,　企業,　市民団体,　行政機関

種別：その他

生殖は、生物が存続する上で最も重要な機構であり、複数の器官が連携して複雑で精緻なシステムを構築しています。その中で、卵巣は性周期を司る重要な組織で、ホルモン分泌などを通して周期的に卵子（卵胞）を受精可能な状態に成熟させ排卵しています。卵巣の働きが良好でないと、卵子の未成熟、排卵障害、生理周期異常などを引き起こし、不妊に至るケースもあります。九州大学大学院歯学研究院口腔細胞工学分野の松田美穂講師と平田雅人主幹教授（現名誉教授・福岡歯科大学客員教授）の研究グループは、自らが発見した分子、PRIP (Phospholipase C Related but Catalytically Inactive Protein)が、卵巣における卵胞成熟過程に作用することを明らかにしました。この分子を持たないマウスでは、出産回数が少なく、一度の出産仔数も少ないのです。調べたところ性周期が乱れ排卵数が減少していました。このマウスの卵巣では、卵胞の成熟が進んでいないために成熟した卵子の数が少なく、排卵数が少なくなっていることが分かりました。つまり、卵子の成熟にはPRIPが必要であるということです。その分子メカニズムの一端も明らかにしました。また、このマウスは人の不妊症の原因の一つである多嚢胞性卵巣症候群（PCOS）に似た特徴を示しました。