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Takehiko Yasumitsu, Koichiro Yamashita, Shigehiko Tamura, Masanori Honsho, Kanji Okumoto, Hiroto Yada, Yuichi Yagita, Hidetaka Kosako, Yukio Fujiki, Phosphorylation of Pex14p regulates peroxisomal protein import., OEPM 2020, 2020.10. |
| 2. |
安光赳彦、山下昂一郎、田村茂彦、本庄雅則、小迫英尊、藤木幸夫, ペルオキシソーム輸送制御におけるPex14pの細胞分裂期特異的なリン酸化とペルオキシン間相互作用の解析, 令和２年度日本生化学会九州支部例会, 2020.05. |
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山下昂一郎, 田村茂彦, 八木田悠一, 小迫英尊, 藤木幸夫, 細胞分裂期特異的なペルオキシソーム形成因子Pex14pのリン酸化による機能制御解析, 第4２回日本分子生物学会, 2019.12. |
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小山桂恵奈, 奥本寛治, 田村茂彦, 藤木幸夫, ペルオキシソーム局在性テイルアンカー型タンパク質ACBD5の翻訳アレストを介した局在化効率獲得機構, 第4２回日本分子生物学会, 2019.12, テイルアンカー型(TA)タンパク質はC末端近傍の1つの膜貫通ドメイン(TMD)を介して形質膜や種々のオルガネラ膜にアンカーされる膜タンパク質群であり、それらの細胞内局在はTMDおよびその下流C末領域のアミノ酸配列に依存する。Acyl-CoA binding domain-containing 5 (ACBD5)は極長鎖脂肪酸のペルオキシソーム内への取込みに関与するペルオキシソーム局在性TAタンパク質である。ACBD5は他のペルオキシソーム膜タンパク質（PMP）と同様にPMPレセプターであるPex19pにサイトゾルで認識され、直接ペルキシソームへ輸送される。近年、タンパク質の翻訳伸長速度は一定でないことが明らかになってきており、私達はACBD5が翻訳時にTMD近辺で弱い翻訳アレストを生じることを観察している。本研究ではACBD5をモデルタンパク質として、新規合成TAタンパク質のペルオキシソーム局在化における翻訳アレストの関与とその意義の解明を目指している。今回、ACBD5のTMDおよびC末領域のアミノ酸配列に対して、コドン使用頻度が逆となる同義コドンへの置換を導入した複数の変異体を作製し、無細胞翻訳系を用いて翻訳伸長速度を解析した。その結果、低使用頻度コドンを高使用頻度コドンに置換したACBD5変異体において、翻訳アレストの減少を認めた。さらに、細胞膜を透過性にしたセミインタクトHeLa細胞上でACBD5のin vitro翻訳反応を進行させることで、翻訳直後のACBD5タンパク質の輸送・局在化を再構成したところ、翻訳アレスト減弱型ACBD5変異体のペルオキシソーム局在化効率は野生型と比較して低下していた。これらの結果から、リボソーム上での翻訳アレストがACBD5のペルオキシソームへの輸送効率を高めていることが示唆された。ACBD5の翻訳アレストとPex19pによるACBD5の認識や品質管理との関連とともに、TAタンパク質のペルオキシソーム局在化において翻訳アレストが果たす役割の一般性についてさらに解析を進めた。. |
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田村茂彦, 奥本寛治, Akemi J. Tanaka, 阿部雄一, Yoel Hirsch, Liyong Deng, Joseph Ekstein, Wendy K. Chung, 藤木幸夫, ペルオキシソーム欠損症病因遺伝子PEX26の新規変異同定とその極軽度障害をもたらす分子メカニズム, 第4２回日本分子生物学会, 2019.12. |
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田村茂彦, 奥本寛治, Akemi J. Tanaka, 阿部雄一, Yoel Hirsch, Liyong Deng, Joseph Ekstein, Wendy K. Chung, 藤木幸夫, ペルオキシソーム欠損症病因遺伝子PEX26の新規変異同定とその極軽度障害の分子メカニズム, 第９２回日本生化学会, 2019.09. |
| 7. |
山下昂一郎, 田村 茂彦, 藤木幸夫, ペルオキシソーム形成因子Pex14pの細胞分裂期特異的なリン酸化による機能制御機構, 第７１回日本細胞生物学会, 2019.06. |
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奥本寛治, 田村 茂彦, 八木田悠一、本庄雅則、藤木幸夫, ペルオキシソーム局在性テイルアンカー型膜タンパク質の輸送局在化機構, 第4１回日本分子生物学会, 2018.11, Tail-anchored (TA) proteins are anchored into the lipid bilayer of organelle membranes by a single transmembrane domain (TMD) near the C-terminus. We demonstrated that several TA proteins are specifically localized to peroxisomes, including a peroxisome assembly factor Pex26p, acyl-CoA binding domain containing protein 5 (ACBD5) called a retinal dystrophy protein involved in peroxisomal fatty acid β-oxidation, and fatty acyl-CoA reductase 1 (Far1), the rate-limiting enzyme of plasmalogen biosynthesis. The guided-entry of TA protein insertion (GET) pathway is the major route of ER-targeted TA proteins that are recognized by a cytosolic ATPase, mammalian TRC40/yeast Get3. In contrast, like other types of peroxisomal membrane proteins (PMPs), mammalian peroxisomal TA proteins are targeted directly from the cytosol to peroxisomes by the cytosolic PMP receptor Pex19p, not by TRC40. However, the molecular mechanism underlying peroxisomal TA protein import remains largely unknown.
Recently, we found that a mitochondrial TA protein, human mitochondrial Rho GTPase-1 (Miro1), has distinct splicing variants that are localized to peroxisomes. We show the unique mode specifying peroxisomal localization of Miro1 variants by Pex19p recognition at the cis-acting region and their role in microtubule-dependent long-distance movement of peroxisomes in cells. We also address several tackling issues involving TA protein synthesis on ribosomes and quality control of nascent TA polypeptides.. |
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山下昂一郎, 田村 茂彦, 藤木幸夫, ペルオキシソーム形成因子Pex14pの細胞周期依存的なリン酸化による機能制御メカニズムの解析, 第９１回日本生化学会, 2018.09. |
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山下昂一郎, 田村茂彦, 藤木幸夫, ペルオキシソーム形成因子Pex14pの細胞周期依存的なリン酸化による機能制御, 平成３０年度 日本生化学会 九州支部例会, 2018.06, ペルオキシソームは多くの重要な代謝機能を有する細胞内小器官であり、その代謝を担う酵素群は膜透過装置の働きでサイトゾルからペルオキシソーム内腔へ輸送される。ペルオキシソーム形成因子のなかでもPex14pは膜透過装置の主要な構成因子であるが、その輸送と制御メカニズムの詳細は未だ明らかにされていない。そこで本研究ではPex14pの翻訳後修飾と膜透過輸送の相関を調べるという切り口からペルオキシソーム機能制御機構の全容解明を目指している。今回、細胞周期に着目して解析を行ったところ、内在性Pex14pは分裂期特異的にリン酸化され、そのリン酸化部位はC末端側ドメインに存在すること、さらにHeLa細胞を用いた形態学的及び生化学的な解析からPex14pがリン酸化されている分裂期ではマトリックスタンパク質の輸送が著しく低下することを見出した。本発表ではこれらの結果に基づき、分裂期特異的なPex14pのリン酸化によるペルオキシソーム機能制御と細胞内恒常性維持について考察する。. |
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小山桂恵奈, 奥本寛治, 田村茂彦, 藤木幸夫, テイルアンカー型タンパク質ACBD5の翻訳速度とペルオキシソームへの輸送・局在化効率の関連性の検討, 平成３０年度 日本生化学会 九州支部例会, 2018.06, Acyl-CoA binding domain-containing 5 (ACBD5)はペルオキシソーム局在性のテイルアンカー型膜タンパク質であり、極長鎖脂肪酸のβ酸化に関与する。ACBD5の膜局在化には、膜貫通ドメイン(TMD)を含むC末領域が必須である。私達はACBD5の翻訳時にTMD近辺で弱い翻訳アレストが生じることを見出している。本研究では、新規に生合成されたACBD5のペルオキシソーム局在化における翻訳アレストの関与とその意義の解明を目指している。
今回、ACBD5のTMD近辺の配列に対して使用頻度が異なる同義コドンへの置換を導入した複数の変異体を作製し、無細胞翻訳系を用いて検討したところ翻訳アレストが減弱した変異体を見出した。さらにセミインタクト化細胞を用いたin vitro輸送系により翻訳30分後の新生鎖ACBD5のペルオキシソームへの輸送を観察したところ、翻訳アレスト低減型変異体のペルオキシソーム局在化効率は野生型より低下していた。これらの結果から、翻訳アレストがACBD5のペルオキシソームへの輸送効率を高めている可能性が示唆された。. |
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田村 茂彦, 河村優子, 藤木幸夫, ペルオキシソーム膜透過装置複合体の同定と輸送メカニズムの解明, 第９0回日本生化学会, 2017.12, ペルオキシソームは多くの必須な代謝機能を担うオルガネラであり、その障害はペルオキシソーム欠損症と呼ばれる遺伝性の致死的疾患をもたらす。ペルオキシソーム形成因子のなかでもPex14pはペルオキシソーム移行シグナルタイプ１の受容体であるPex5pのペルオキシソーム膜上ドッキングタンパク質であり、Pex5p-マトリクスタンパク質複合体のペルオキシソームマトリクスへの移入を担うことが知られている。当研究室ではこれまでに、Pex14pを主な構成因子とする3種の複合体I (600 kD)、II (770 kD)、III (1,100 kD)を見いだし、これらが協調して膜透過輸送を担うことを示唆する結果を得ているが、マトリクスタンパク質輸送メカニズムの詳細は未だ明らかになっていない。そこで、本研究ではPex14pがホモオリゴマーを形成するために必要な構成的基盤を明らかにするとともに、これら3種複合体の動的構成変化を伴う膜透過輸送の分子メカニズムを解析した。
Pex5pとの相互作用による複合体IIIから複合体IIへの構成変化はマトリクスタンパク質存在下で促進され、なおかつAAAペルオキシンであるPex1pやPex6pおよびATPに依存的な構成変化であることを見出した。また、輸送再構成実験系を用いた解析から複合体IIIが実際にPex5pの輸送を担うこと、さらに複合体IIIからIIへの構成変化を抑制したところ、マトリクスタンパク質の輸送能が著しく低下することを明らかにした。加えて、複合体IIからPex5pが解離することによって複合体Iが形成されることを示唆する結果も得ている。すなわち、これら3種の複合体が構成を変化させながらマトリクスタンパク質の輸送を担っていると考えられる。本発表では、これらの結果を踏まえて、3種の複合体が担うマトリクスタンパク質輸送の分子メカニズムについて考察する。. |
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河村優子, 田村 茂彦, 藤木幸夫, ペルオキシソーム膜透過輸送にはPex14p複合体の動的な構造変化が必要である, 「新生鎖の生物学」班会議（別府）, 2017.11. |
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藤木幸夫, 奥本寛治, 八木田悠一, 田村 茂彦, ペルオキソソームの恒常性：膜およびマトリックスタンパク質輸送の分子基盤, 第１７回日本蛋白質科学会年会, 2017.06. |
| 15. |
Yukio Fujiki, Yuko Kawamura, and Shigehiko Tamura, Peroxisomal matrix protein transport requires a series of constitutional changes of Pex14p homo-oligomers, EMBO conference "Protein translocation and cellular homeostasis", 2017.03. |
| 16. |
Yukio Fujiki, Yuko Kawamura, and Shigehiko Tamura, Core components of peroxisomal membrane translocator of matrix proteins. EMBO conference, EMBO conference "Protein translocation and cellular homeostasis", 2017.03. |
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Yuqiong Liu, 田村茂彦, 奥本寛治, 八木田 悠一, 河村優子, 永田愛子, 藤木幸夫, ペルオキシソーム形成の分子基盤: 膜生合成およびマトリックスタンパク質輸送の分子機構, 第３９回日本分子生物学会, 2016.12, Peroxisomes are multi-functional organelles in eukaryotic cells. Defects in peroxisome biogenesis cause a large group of fatal inherited metabolic diseases such as Zellweger syndrome spectrum that are linked to mutations in PEX genes encoding peroxins. Peroxisomal membrane proteins (PMPs) can be translocated to peroxisomes directly from the cytosol or indirectly via the endoplasmic reticulum. Pex19p interacts with PMPs on one hand and Pex3p on the other. We show here that Pex19p indeed forms cytosolic complexes with topologically distinct PMPs and directly translocates them to peroxisomes in a manner dependent on the membrane peroxin Pex3p, termed the class I pathway. Moreover, we demonstrate that in mammalian cells several C-tail anchored proteins (TAs) including Pex26p and a retinal dystrophy protein are also transported to peroxisomes by the class I pathway, not the TRC40/Get3 pathway.
Peroxisomal matrix proteins are imported into peroxisomes via membrane-bound docking/translocation complex comprising as a major component membrane peroxin Pex14p that binds Pex5p, a peroxisomal targeting signal type-1 (PTS1) receptor. We very recently isolated as a docking/translocation complex three types of Pex14p complexes, termed complexes I, II, and III, with molecular masses 600 kDa, 770 kDa, and 1,100 kDa, respectively. The complex I is assembled as a dodecamer of Pex14p. The complexes II and III contain Pex5p, while Pex13p is required only for assembly of the complex III. Transition of Pex14p complex structures between the complexes I, II, and III more likely plays important roles in matrix protein import. We will address the mechanisms underlying the assembly of peroxisomes.. |
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河村優子, 田村 茂彦, 藤木幸夫, ペルオキシソーム膜透過輸送にはPex14p複合体の動的な構成変化が必要である, 第３９回日本分子生物学会, 2016.12, ペルオキシソームは多くの必須な代謝機能を有するオルガネラであり、その障害はペルオキシソーム欠損症と呼ばれる遺伝性の致死的疾患をもたらす。ペルオキシソーム形成因子のなかでもPex14pはペルオキシソーム移行シグナルタイプ１の受容体であるPex5pのペルオキシソーム膜上ドッキングタンパク質であり、Pex5p-マトリクスタンパク質複合体のペルオキシソームマトリクスへの移入を担うことが知られている。当研究室ではこれまでに、Pex14pを主な構成因子とする3種の複合体I (600kD)、II (770kD)、III (1100kD)を見いだし、これらが協調して膜透過輸送を担うことを示唆する結果を得ているが、その輸送メカニズムの詳細は未だ明らかにされていない。そこで、本研究ではPex14pがホモオリゴマーを形成するために必要な構成的基盤を明らかにするとともに、これら3種複合体の動的な複合体構成変化と膜透過輸送能の機能的な相関に着目して解析を行った。. |
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田村 茂彦, 河村優子, 藤木幸夫, Identification of core components of peroxisomal membrane translocator., 第８９回日本生化学会, 2016.09, Peroxisomal matrix proteins are imported into peroxisomes via membrane-bound docking/translocation complex comprising as a major component membrane peroxin Pex14p that binds Pex5p, a peroxisomal targeting signal type-1 (PTS1) receptor. However, molecular mechanism underlying peroxisome matrix protein import remains elusive, because components and their functional roles of the docking/translocation complex are little defined.
We very recently isolated by BN-PAGE method as a docking/translocation complex three types of Pex14p complexes, termed complexes I, II, and III, with molecular masses 600 kDa, 770 kDa, and 1,100 kDa, respectively. The complex I is assembled as a dodecamer of Pex14p. The complexes II and III contain Pex5p, while Pex13p is required only for assembly of the complex III. The complex III dissociates into the complex II by interacting with either Pex5p or Pex5p-PTS1 cargo complexes. Moreover, Pex5p binding to PTS1-cargo protein enhances the dissociation of complex III. Transition of Pex14p complex structures between complexes I, II, and III more likely plays important roles in matrix protein import. On the other hand, complex I binds to Pex5p, not Pex5p-PTS1 cargo complexes, suggesting that the complex III is responsible for the peroxisome matrix protein import. Taken together, peroxisomal protein transport correlates well with the dissociation of complex III which is a translocator complex consisted of Pex14p. We will discuss potential roles of the peroxisomal docking/translocation complex in matrix protein transport.. |
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Shigehiko Tamura, Kanji Okumoto, Naomi Matsumoto, Yuri Shirahama, Ryota Takeba, Yukio Fujiki, Mechanistic insight into peroxisomal protein import, EMBO Conference: Mechanisms and regulation of protein translocation, 2015.03. |
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田村 茂彦, 小川智大, 藤木 幸夫, ペルオキシソーム膜透過装置複合体の同定とマトリックスタンパク質輸送の分子メカニズム解明, 第８7回日本生化学会, 2014.10, ペルオキシソームは多くの重要な代謝機能を有するオルガネラであり、その障害はペルオキシソーム欠損症と呼ばれる遺伝性の致死的疾患をもたらす。ペルオキシソーム形成因子 (ペルオキシン) の中でもPex14pはペルオキシソーム移行シグナルタイプ１の受容体であるPex5pのペルオキシソーム膜上ドッキングタンパク質であり、Pex5p – マトリックスタンパク質複合体のペルオキシソーム内腔への輸送を担うことが知られている。しかしながら、Pex14pを主な構成因子とする膜透過装置複合体の組成・構造およびその輸送メカニズムの詳細は明らかにされていない。そこで、本研究ではペルオキシソーム膜透過装置複合体の構造と膜透過輸送能に関する知見を得ることで、その輸送機序を解明することを試みた。
我々は、BN (Blue-Native) – PAGEを用いた解析から、Pex14pを主な構成タンパク質とする３種の複合体を見いだし、それぞれを複合体Ⅰ（600 kDa）、複合体Ⅱ（720 kDa）、複合体Ⅲ（1050 kDa）と名付けた。それぞれの複合体をリポソーム膜上に組み込んだ再構成実験系を構築し、Pex5pの膜内腔への輸送能を調べたところ、複合体ⅡとⅢが輸送活性を持つことを明らかにした。また、Pex5p–マトリックスタンパク質複合体は複合体Ⅲと相互作用し、複合体Ⅲの解離に伴って複合体ⅡおよびⅢへ構造変換させること、さらに、AAAペルオキシンであるPex1p欠損性の細胞およびATPを枯渇させた細胞培養条件下では複合体Ⅲが蓄積することを見いだした。つまり、これら３種のPex14p複合体はダイナミックに構造を変えながらマトリックスタンパク質の輸送に協調的に働くことが示唆された。本発表では、これらの結果を踏まえてPex5pとペルオキシソームマトリックスタンパク質輸送の分子メカニズムについて考察する。. |
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田村 茂彦, 矢田裕人, 藤木 幸夫, ペルオキシソームタンパク質膜透過装置複合体の同定と膜透過メカニズム, 第８６回日本生化学会, 2013.09, ペルオキシソームは多くの重要な代謝機能を有するオルガネラであり、その障害はペルオキシソーム欠損症と呼ばれる遺伝性の致死的疾患をもたらす。ペルオキシソーム形成因子 (ペルオキシン) の中でもPex14pはペルオキシソーム移行シグナルタイプ１の受容体であるPex5pのペルオキシソーム膜上ドッキングタンパク質であり、Pex5p – マトリックスタンパク質複合体のペルオキシソーム内腔への輸送を担うことが知られている。しかしながら、Pex14pを主な構成因子とする膜透過装置複合体の組成・構造およびその輸送メカニズムの詳細は明らかにされていない。そこで、本研究ではペルオキシソーム膜透過装置複合体の構造と機能に関する知見を得ることで、その輸送機序を解明することを試みた。
我々は、BN (Blue-Native) – PAGEを用いた解析から、Pex14pを主な構成タンパク質とする３種の複合体を見いだし、それぞれを複合体Ⅰ（600 kDa）、複合体Ⅱ（720 kDa）、複合体Ⅲ（1050 kDa）と名付けた。このうち複合体ⅡとⅢにはPex5pが含まれており、これら３種のPex14p複合体がPex5pとマトリックスタンパク質の内腔への輸送に協調的に働くことが示唆された。また、Pex13pを欠損したヒト患者由来細胞では複合体Ⅲが形成されず、一方、AAAペルオキシンであるPex1p欠損性の細胞およびATPを枯渇させた細胞培養条件下では複合体Ⅲの蓄積が観察された。さらに、複合体Ⅰ、Ⅱ、Ⅲをそれぞれ人工リポソーム膜へ導入することで、Pex5p輸送の再構成実験系を構築することに成功した。本発表では、これらの結果を踏まえてPex5pとペルオキシソームマトリックスタンパク質輸送の分子メカニズムについて考察する。. |
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田村 茂彦, AAAペルオキシンとPex26pによって制御されるペルオキシン間相互作用, 第８５回日本生化学会, 2012.12, 数多くのペルオキシソーム形成因子（ペルオキシン）のなかでもPex1pおよびPex6pはAAA-ATPaseファミリーに属し、いずれの機能障害も重篤な先天性代謝異常症であるペルオキシソーム欠損症の病因となる。ペルオキシソーム移行シグナル１の受容体であるPex5pはシトゾールからそのペルオキシソーム膜上ドッキング因子Pex14pにターゲッティングされ、AAAペルオキシンであるPex1p、Pex6p、およびPex26pとのヘテロ複合体を介して、シトゾールへエクスポートされる。このようにPex5pは他のペルオキシンと協調的に働き、または制御されることでタンパク質輸送を担うものと考えられている。しかしながら、Pex5pのダイナミックな機能とその制御の詳細は分子レベルでは未だ明確でない。そこで今回は、AAAペルオキシンとPex26pがPex5pと他のペルオキシンとの相互作用を調節する作用機序解明に焦点を合わせ検討した。
まず、Pex26pがPex1p-Pex6pまたはPex14p-Pex5p複合体と結合する領域をそれぞれ同定し、Pex26pはAAAペルオキシンの作用標的を導く足場タンパク質となり得ること、そしてAAAペルオキシンはATP加水分解と共役してPex26pとPex14pの結合を解離させることが示唆された。また、Pex26pとPex14pの結合はPex5pとの相互作用に依存したPex14pの構造変化によって抑制されることも示唆された。さらに、Pex26pと複合体を形成していないPex1pはPex5pのホモオリゴマーと直接結合し得ることを明らかにした。このことは細胞質に存在するPex1pがPex5pのオリゴマー構造の制御に関与している可能性を示唆している。これらの知見を合わせ、Pex26pを介したAAAペルオキシンによるPex14p-Pex5p複合体への機能的な相互作用、さらにはペルオキシソーム形成におけるPex5pのダイナミックなペルオキシン間相互作用の制御について考察する。. |
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田村茂彦, ペルオキシソーム形成とその障害の分子メカニズム, 先端医療薬学研究センター講演会, 2012.03. |
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田村茂彦, 藤木幸夫, AAA peroxins and their recruiter Pex26p modulate the peroxin interactions involved in peroxisomal protein import, AAA国際シンポジウム, 2011.11. |
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田村茂彦、中村博美、藤木幸夫, ナンセンス変異の抑制によるペルオキシソーム障害の回復メカニズム, 日本生化学会, 2011.09. |
| 27. |
田村茂彦、藤木幸夫, BN-PAGEによるペルオキシン複合体の解析, 日本蛋白質科学学会, 2011.06. |
| 28. |
田村茂彦、竹場亮太、藤木幸夫, AAAペルオキシンとPex26pによって制御されるペルオキシン相互作用, 日本生化学会・分子生物学会, 2010.12. |
| 29. |
田村茂彦、中村博美、藤木幸夫, Restoration of peroxisome biogenesis in perosxisome-deficient cells with a nonsense suppressor compound (G418)., The 3rd International Symposium on Protein Community, 2010.10. |
