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諌早怜士，齋藤悠々，竹之内学睦，＠林武司，＠山内伸彦, ウシ子宮内膜組織におけるmiRNAの網羅的解析, 第115回日本繁殖生物学会 東京大会, 2022.09, 【目的】近年miRNAがエクソソームを介して細胞機能を制御することが注目されており，子宮内膜で発現するmiRNAが胚の伸長や着床過程で重要な役割を担うことが示唆している。しかし，ウシ子宮内膜で発現するmiRNAの種類や発現量などの全体像は明らかにされていない。そこで本研究では，ウシ子宮内膜で発現するmiRNAの着床過程における機能解析を最終目的とし，卵胞期，黄体期および着床期のウシ子宮内膜組織に含まれるmiRNAを網羅的に解析した。【方法】卵胞期，黄体期および着床期のウシ子宮内膜組織からRNAを抽出し，miRNA sequence解析によってそれぞれのステージ間のmiRNA発現を網羅的に解析した。さらにmiRNA sequence解析の結果をもとに，in silico解析により着床過程の制御機構に関与すると考えられるmiRNAの探索および特定を行った。その結果をもとに，miRNAのターゲット遺伝子およびその遺伝子が関与するウシ子宮内膜の制御機能の探索を行った。【結果】各ステージ間における既知miRNAおよび新規miRNAの数は卵胞期で297個および77個，黄体期では317個および81個，着床期では293個および435個確認された。GO機能エンリッチメント解析の結果，それぞれのステージで発現が上昇したmiRNAのターゲット遺伝子の多くは細胞構成成分，中でも細胞質，細胞膜，膜貫通型タンパク質の機能に関与するものであった。また，そのヒストグラム解析ではコラーゲン含有細胞外マトリックスに関与する遺伝子が最も高い値を示した。さらに，黄体期と着床期で変化倍率が1.5倍以上かつ片方のステージで1000リードを越えるmiRNAは合計35個確認された。その内、黄体期で発現が上昇したmiRNAは既知が14個、着床期で上昇したものは既知が19個、新規が2個であった。これらのmiRNAは胚性因子によって制御されている可能性が示唆された。. |
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小川紗良，谷口楓果，齋藤悠々，西野大地，＠木崎景一郎，＠高橋透，＠山内伸彦, ウシ栄養膜細胞のIFNt発現制御因子の検索, 第115回日本繁殖生物学会 東京大会, 2022.09, 【目的】ウシを含む反芻動物の胚は伸長過程において栄養膜細胞より妊娠認識物質であるインターフェロンタウ(IFNt)を産生する。しかし，その具体的な制御因子は未だ明らかにされていない。反芻動物の妊娠成立におけるIFNtの重要性を考えると，その制御機構の解明は受胎率の向上において大きな意義を有する。本研究では，ウシ胚盤胞期胚由来の栄養膜細胞(BT細胞)を用い，そのIFNt発現に対する子宮内膜産生因子の影響を調べた。【方法】BT細胞の培養には5%ウシ胎子血清含有DMEM/F12を基礎培地として用いた。IFNt発現を制御する因子の候補として子宮内膜で産生されるBetacellulin(BTC)，Heparin-binding EGF-like growth factor(HB-EGF)，Insulin-like growth factor 1 (IGF1)およびC-C Motif chemokine ligand 2(CCL2)の影響を解析した。それぞれの因子の受容体遺伝子の発現をRT-PCRによって，IFNtの遺伝子発現をqPCRによって解析した。また，Western blottingによってIFNtタンパク質の発現を解析した。【結果】RT-PCRの結果，BT細胞においてそれぞれの因子の受容体遺伝子が検出された。qPCRの結果，100ng/mlの濃度でそれぞれの因子を添加したBT細胞におけるIFNt遺伝子の発現は，それぞれ1ng/mlの濃度で添加したBT細胞よりも高くなっていた。Western blottingの結果，BT細胞におけるIFNtタンパク質の発現は，無添加区よりも高かった。本研究の結果，子宮内膜で産生されるBTC，HB-EGF，IGF1およびCCL2を高い濃度でBT細胞に添加するとIFNtの発現が促進されることが示された。. |
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齋藤悠々，諫早怜士，竹之内学睦，林武司，＠木崎景一郎，＠高橋透，＠山内伸彦, ウシ栄養膜細胞に対する子宮内エクソソームの影響, 第115回日本繁殖生物学会 東京大会, 2022.09, 【目的】ウシ胚は着床前に細長く伸長するとともに妊娠認識物質であるIFNtを産生する。胚伸長期は妊娠の律速段階であり、子宮内膜因子の制御下で促進されることが報告されている。一方、エクソソーム（Exo）がこの過程においてどのような作用を及ぼすかは明らかにされていない。本研究では、子宮内に存在するExoが胚伸長およびIFNtの産生に与える影響を明らかにすることを目的とし、ウシ胚由来の培養栄養膜細胞(BT細胞)を用いてその影響を解析した。【方法】Exoは黄体期(L)および妊娠8日目(P8)のウシ子宮灌流液からアフィニティー法によって単離した。BT細胞は5%FBS添加DMEM/F12培地を基礎培地とし、コラーゲンコート処理ディッシュで培養した。Exoの細胞への取り込みを確認するため、膜染色色素を用いてExoを蛍光標識し、培地へ添加4h後にヘキスト染色を行い、蛍光顕微鏡下で観察した。また、Exo添加によるBT細胞の形態的変化について観察した。さらに、無血清培地へL-ExoまたはP8-Exoを添加し、BT細胞の細胞増殖関連遺伝子(PCNA,CCND1)およびIFNt遺伝子の発現量をqPCRにより測定し、Exo無添加区と比較した。【結果】蛍光顕微鏡下で観察した結果、蛍光標識されたExoが栄養膜細胞に取り込まれていることが確認された。また、Exo無添加区では小胞が消失していたのに対し、Exo添加区では小胞構造が維持されていた。qPCRの結果、Exo無添加区、L-Exo添加区と比較して、P8-Exo添加区においてPCNA,CCND1およびIFNt遺伝子の発現量が有意高い値を示した（P |
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Tao Pan、CHISUN YUN、Nobuhiko Yamauchi, Regulation mechanism of β-catenin in Bovine Endometrium, 第1１４回日本繁殖生物学会, 2021.09, [Introduction] The elevation of β-catenin in the endometrium is reported in several mammalian species, including cattle. It has been considered that accumulated β-catenin acts as a transcription factor to regulate endometrial remodeling and implantation. It is generally known that the WNT induces the accumulation of β-catenin, but in some cases, other factors such as IGF1 also have a similar function. Each ligand involves phosphorylation of different proteins in the process of its signal transduction, LRP6 (WNT pathway) or GSK3β (IGF1 pathway), respectively. The present study aimed to clarify the regulation mechanism of β-catenin in the bovine endometrium. [Methods] Bovine endometrial epithelial cells (BEE) were treated without or with LiCl (positive control), WNT agonist AMBMP, and recombinant IGF1, respectively. The levels of β-catenin, phosphorylated LRP6 (pLRP6), and phosphorylated GSK3β (pGSK3β) were measured by western blotting. The potential downstream genes of the β-catenin (SLC2A1, MYC, and CCND1) were analyzed by qPCR. [Results] The treatment of LiCl, AMBMP, and IGF1 increased the levels of β-catenin and downstream genes in BEE. The levels of pLRP6 and pGSK3β in endometrial tissues were significantly high at luteal and implantation stages compared to the follicular stage. [Conclusions] The elevations of pGSK3β and pLRP6 suggested that both WNT and IGF1 pathways might exist in the bovine endometrium. Analysis of downstream genes in BEE showed that its expression pattern could be similar regardless of the ligand and its pathway. Collectively, these results imply that in the bovine endometrium, WNT and IGF1 pathways may contribute together to the regulation of β-catenin.. |
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CHISUN YUN、Tao Pan、Nobuhiko Yamauchi, CCL2 regulates prostaglandin circulation and embryo attachment of the bovine endometrium during implantation , 第1１４回日本繁殖生物学会, 2021.09, [Introduction] CCL2 (C-C motif chemokine ligand 2), which is known to recruit immune cells to the sites of inflammation, has been reported to be expressed in the bovine endometrium. We have reported that CCL2 induced proliferation and stimulated the expression of prostaglandin (PG) synthases in cultured endometrial cells. However, the details of how CCL2 involved in the implantation mechanism are still unclear. The purpose of present study is to analyze the functional properties of CCL2 in the bovine endometrium and embryo. [Materials and Methods] Bovine endometrial tissue, epithelial (BEE) and stromal (BES) cells, and bovine blastocyst-derived trophoblastic (BT) cells were used for the analysis. Gene expressions were analyzed by RT-PCR or qPCR. [Results] Since the previous results showed that both expressions of PGESs and PGFSs were high, we focused on the analysis of PG transporter genes (MRP4 and PGT). The amount of MRP4 and PGT were significantly high in CCL2 treated BEE and BES in vitro. The mRNA of chemokine receptors (CCR1, CCR2 and CXCR3) were detected in BT. The amount of PCNA and IFNt were significantly high in BT treated with CCL2. CCL2 significantly increased the attachment rate of BT vesicles to BEE in in vitro co-culture system. The amount of OPN increased in BEE, and ICAM-1 increased both in BEE and BT by CCL2 treatment. These results indicated that CCL2 has the potential to regulate the circulation of PGs in bovine endometrium and embryo growth. In addition, CCL2 has a possibility of regulating the process of bovine embryo attachment to endometrium by modulating expression of binding molecules.. |
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CHISUN YUN、Daichi Nishino、Shutaro Horaku、Nobuhiko Yamauchi, Expression and Function of Chemokines in Bovine Endometrium and Embryos
, 第128回日本畜産学会, 2021.03, Chemokines, which mainly regulate immune cells, also involve the cellular remodeling in endometrium of human and rodents during pregnancy. However, the expression and function of chemokines in the bovine uterus remains still unclear. The purpose of this study is to analyze the expression pattern and functional properties of chemokines in the bovine endometrium and embryos. The qPCR analysis of the tissue showed that the amount of CCL2, CCL8 and CXCL10 transcripts were high at the implantation stage. The amount of CCL2 transcripts was significantly high in IFNa treated bovine endometrial stromal (BES) cells in vitro. In bovine endometrial epithelial (BEE) cells, however, the amount of CCL8 and CXCL10 were significantly high in the treatment group, but not for CCL2. The mRNA of each chemokine receptors was detected in the endometrial tissues and embryos by RT-PCR. Cellular proliferation of BEE and BES significantly increased by the CCL2 treatment. These results indicate that the expression of chemokines increased in endometrium during implantation and possible to regulate the proliferation of both endometrium and embryos.. |
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潘韜、尹治善、西野 大地、寶楽 修太郎、山内 伸彦, Analysis of WNT/β-catenin pathway in Bovine Endometrial Cells In Vitro, 第128回日本畜産学会, 2021.03, It is reported that the WNT/β-catenin pathway is important for endometrial remodeling and embryo implantation. The present study aimed to analyze the WNT/β-catenin pathway in the bovine endometrial cells. Gene expression of potential WNT/β-catenin pathway components in bovine endometrial epithelial cells (BEE) and stromal cells (BES) were analyzed by RT-PCR. Then, BEE was treated with WNT/β-catenin pathway agonist AMBMP in vitro. The β-catenin protein level was measured by western blotting and the amounts of downstream genes were analyzed by qPCR. WNT/β-catenin pathway ligands Wnt2 was detected in both BEE and BES, Wnt3 was not detected in both types of cells, and Wnt7A was only detected in BEE. WNT/β-catenin pathway receptors LRP5, LRP6, FZD1, FZD4, and FZD7 were detected in both cells. The mRNA for the potential WNT7A-specific receptor FZD5 was expressed only in BEE. Treatment of AMBMP significantly increased the amount of β-catenin protein in BEE. In conclusion, it was demonstrated that the BEE process a functional WNT/β-catenin pathway in vitro. The amounts of downstream genes in the WNT/β-catenin pathway are currently being analyzed.. |
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Al-Nur Md. Iftekhar Rahman, Toru Takahashi, Nobuhiko Yamauchi, MMP3 mediates E2-induced endometrial cell proliferation by releasing , 第113回日本繁殖生物学会, 2020.09, 【Introduction】Cyclic cell proliferation and endometrial remodeling during the estrous cycle is important to maintain normal endometrial function. It has been reported that endometrial cells are actively proliferating at the follicular stage in cattle. However, the control mechanism of this cell proliferation has not yet been clarified. Recently it has been reported the possibility that protease enzyme matrix metalloproteinase-3 (MMP3) can regulate the cell proliferation. In the present study, the function of MMP3 on the proliferation of endometrial cells was analyzed.【Materials and Methods】Bovine endometrial stroma (BES) and epithelial (BEE) cells were cultured in DMEM/F12 containing 10%FBS. Gene expression was analyzed by qPCR. Protein expression of MMP3 and HB-EGF were analyzed by casein zymography and western bottling, respectively. Cell proliferation was analyzed by automated cell counter.【Results】 MMP3 highly expressed at follicle stage compared to luteal and implantation stage. E2 increased the gene expression and clearance of MMP3 in BES in vitro, but P4 and IFNα decreased the expression. E2 also increased the cell proliferation of BES, but the inhibitor of MMP3 and EGFR inhibited the proliferation induced by E2. Further, E2 increased the HB-EGF release in BES but MMP3 inhibitor suppressed this release. There was no direct effect of E2 on BEE cell proliferation. However, the condition medium of BES treated with E2 increased the BEE proliferation, but was inhibited by EGFR inhibitor. It was shown that E2 induces MMP3 expression and promotes HB-EGF release from BES. These results suggested that MMP3 is involved in the proliferation mechanism of endometrial cells in the follicular stage.. |
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松宮敦史，高武亜衣，黒木優美，西野大地，山内伸彦, マトリゲル内培養におけるウシ子宮内膜上皮細胞の遺伝子発現解析, 第12回日本日本暖地畜産学会 大分大会, 2019.10, 【目的】子宮腺上皮は反芻動物の胚伸長に必須の因子を産生することが報告されている．本研究では，腺上皮様構造を再構築できるマトリゲル内培養を用いてウシ子宮内膜上皮（BEE）を培養し，腺上皮特異的遺伝子の発現解析を行った．【方法】培養4日目のマトリゲル内培養下のBEEを用いて以下の実験を行った．①単層BEEと比較し、腺上皮特異的遺伝子（SERPINA14、GRP，FOXA2）の発現を解析した。②単層培養間質細胞の上部で①と同様のBEEのマトリゲル内培養を行い，P4 (10-6M)，IFNα（100IU/ml）およびP4＋IFNα処理後にSERPINA14，および妊娠13日目の子宮内膜で発現する分泌性因子であるBTC, PDGHB, MSTN, FGF13の発現を解析した．【結果】①単層培養BEEと比較し，マトリゲル内培養下BEEにおいてFOXA2の発現に変化は認められなかったが，SERPINA14およびGRPの発現は有意に高い値を示した(P |
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竹之内学睦，高橋凛，山口勇人，寳樂修太郎，山内伸彦, ウシ子宮内膜におけるP4の間接的制御とIGF1の役割, 第12回日本日本暖地畜産学会 大分大会, 2019.10, 【目的】子宮内膜は主に間質細胞（BES）と上皮細胞（BEE）から構成されており，卵巣ステロイドホルモンや胚性因子だけではなく，細胞間同士の相互作用によってもその機能は制御されている．本研究では，P4によるBEE機能の制御機構の解明を目的とし，BESにおけるIGF1の発現とそのBEEに対する影響を解析した．【方法】BESのホモスフェロイドを用いてIGF1の発現に対するP4(1μM)の効果を解析した．ついで，リコンビナントIGF1（rIGF1）を用いてBEEの遺伝子発現に与える影響を解析した．さらに，BESとBEEのヘテロスフェロイドを用いた解析を行った．P4とIGF1阻害剤（AG1024）の共添加を行い，BEEで発現する遺伝子に対する影響を解析した．【結果】P4処理によりホモスフェロイドにおいてIGF1遺伝子の発現が有意に上昇した(P＜0.05)．rIGF1処理によりBEEにおけるBCL2およびSLC2A1の発現が有意に上昇した(P＜0.05)．さらに，ヘテロスフェロイドにおいてP4処理によりSLC2A1の発現が有意に上昇した(P＜0.05)．一方，AG1024とP4の共処理区ではSLC2A1の発現上昇は認められなかった．以上の結果から，P4がBES由来のIGF1を介してBEEにおけるSLC2A1の発現を制御している可能性が示唆された．. |
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Al-Nur Md. Iftekhar Rahman, Hayato Yamaguchi, Shutaro Horaku, Daichi Nishino, Qudratullah Qani, Toru Takahashi, Nobuhiko Yamauchi, Expression and regulation of MMP3 in bovine endometrial cells in vitro, 第126回日本畜産学会, 2019.09, Matrix Metalloproteinase 3 (MMP3) plays an important role in endometrial remodeling as well as for successful implantation in bovine. There are few information for MMP3 production and its regulation in bovine endometrium till now. Therefore, this study aimed to characterize MMP3 expression in bovine endometrial cells in vitro. Bovine endometrial stroma (BES) and epithelial (BEE) cells were cultured without or with E2, P4 and IFNα (type-I interferon) for gene and zymographic analysis, respectively. The results of qPCR showed that gene expression of MMP3 was significantly high for E2 treated BES cells compared with the other groups. BEE cells had no effects in either of these treatments for MMP3 gene expression. Casein zymography showed that BES cells secrete MMP3 after 48 h of culture, where as BEE did not show any zymographic activity. Furthermore, MMP3 clearance was significantly high when BES was treated with E2. Secretion of MMP3 was significantly decreased when treated with P4 or IFNα. These results indicate that BES release MMP3 and the expression was regulated by E2, P4 and type-I interferon.. |
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Qudratullah Qani, Al-Nur Md. Iftekhar Rahman, Hayato Yamaguchi, Daichi Nishino, Shutaro Horaku, Nobuhiko Yamauchi, Gene expression of IRFs in bovine endometrial epithelial and stromal cells in vitro, 第126回日本畜産学会, 2019.09, Interferon regulatory factors (IRFs) have a key role in IFN signaling for ISGs expression in the endometrium of ruminants including bovine. However, bovine endometrial cell types are not characterized for the expression of IRFs. The aim of this study was to characterize bovine endometrial epithelial (BEE) and stromal (BES) cells for the expression of the IRFs in vitro. Both types of cells were cultured without or with E2, P4 and IFNα for 24 h. Gene expression of IRF1, 4, 6 and 9 was analyzed. The result of RT-PCR showed that BEE expressed IRF1 and 6, and BES expressed only IRF1. IRF4 and 9 was not detected in both cell types. However, IRF9 was expressed in both cell types treated with IFNα. RT-qPCR results showed that IFNα significantly increased the expression of IRF9 for BEE, and IRF1 and 9 for BES (P |
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寳樂 修太郎、山口 勇人、西野 大地、山内 伸彦, ウシ子宮内膜上皮細胞におけるOTRおよびPGRの遺伝子発現, 第126回日本畜産学会, 2019.09, 【目的】黄体の退行は，子宮内膜上皮細胞におけるオキシトシンレセプター（OTR)の急激な発現上昇が引き金となって誘起されると考えられているが，その制御機構はいまだ不明な点が多く残されている．そこで本研究ではOTRとP4レセプター（PGR）の関係に着目し，培養ウシ子宮内膜上皮細胞（BEE）におけるそれぞれの遺伝子発現を解析した．【方法】培地にE2(100nM)，P4(1mM)またはⅠ型IFN（IFNa，100IU/ml）をそれぞれ添加し，BEEのOTRおよびPGRの発現に対する影響をqPCRによって調べた．ついで，P4長期暴露の効果を調べるため，培地にP4(1μM)を添加し6，12および18日培養後のOTRおよびPGRの発現を調べた．【結果および考察】E2添加区では培養24hでOTRおよびPGRの発現が対照区と比較して有意に高い値を示した（P |
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Nobuhiko Yamauchi, Analysis of Bovine Endometrial Functions Using Three-dimensional Cultured Cells, The 18th International Symposium on Developmental Biology, 2018.11, Importance of the in vitro model of tissues or organs is now evident in tissue engineering and cell biology research. Till now, two-dimensional culture systems have been using for in vitro cell culture, and have contributed to cell function studies despite their limitations. Three-dimensional (3D) culture has been utilized in cell biology research because it appears to mimic morphology and physiology of cells in living tissues and organs, unlike conventional monolayer cell culture. In our laboratory, we are developing 3D culture systems of bovine endometrial cells as a tool for the analysis of uterine endometrial functions. Among them, this lecture introduces spheroid culture and Matrigel culture.
1. Spheroid culture; Spheroids are a spherical mass composed of cells and extracellular matrices (ECMs). We have regenerated multicellular spheroids composed of bovine endometrial stromal and epithelial cells using ascorbate (1). Expression of MMPs, which are key enzymes for the tissue remodeling of the endometrium, were analyzed using the spheroid. E2, P4 and type-I IFN did not affect the gene expression of MMPs in the spheroid. However, treatment of type-I IFN increased the clearance of MMPs in the supernatant. These results suggest that IFN indirectly regulates endometrial tissue remodeling through clearance of MMPs.
2. Matrigel culture; It is reported that cells form lumens automatically by culturing cells in Matrigel (2). Matrigel is a solubilized basement membrane extracted derived from EHS mouse sarcoma cells. The bovine endometrial epithelial cells cultured in 15% Matrigel formed a circular or elliptical gland-like structure. Gene expressions of glandular epithelial specific factors (FOXA2, SERPINA14 and GRP) were significantly high in the Matrigel, compared to the monolayer cultured cells, except FOXA2. Further, SERPINA14 expression was affected by neither P4 nor IFN. However, when epithelial cells in Matrigel were co-culture with stromal cells, SERPINA14 expression increased significantly in the treatment of both P4 and IFN. These results suggest that bovine endometrial epithelial cells cultured in Matrigel show properties similar to the glandular epithelial cells in vivo, and regulated by the factors produced by the stromal cells.
Finally, by using these 3D culture systems, it becomes possible to clarify not only factors regulating embryo elongation and implantation but also regulation of their expression. It will be able to reveal the mechanism of the embryo elongation and implantation to contribute to the improvement of the embryo transplantation technique.
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西野大地，深田簡子，高橋凛，政家裕典，山内伸彦, ウシ胚の伸長に関わる子宮内膜産生因子の遺伝子探索, 第11回日本日本暖地畜産学会 長崎大会, 2018.10, 【目的】ウシ胚は透明帯脱出後に細長い紐状へと伸長し，その後着床に至る．胚の伸長期はウシの妊娠成立における最も大きな律速段階であることが報告されている（Diskin et al., 2008）．しかし，そのメカニズムおよび関連因子は依然明らかにされていない．本研究では，ウシ胚の伸長を促進し得る子宮内膜産生因子の探索を目的とした．
【方法】妊娠13日目のウシ子宮内膜におけるRNAseq解析の結果から，発現遺伝子において細胞外に分泌され機能的に作用するサイトカインをGO解析によって特定した．ついで，伸長期胚の発現遺伝子を解析し，特定したサイトカインの受容体の発現について検索した．子宮内膜で発現し，かつ伸長期胚でその受容体が発現している遺伝子に関して，培養系を用いてウシ子宮内膜上皮細胞における遺伝子発現をRT-PCRにより解析した．
【結果】RNAseq解析の結果より，妊娠13日目のウシ子宮内膜組織では56個のサイトカイン遺伝子が発現していた．そのうち胚にその受容体遺伝子が発現し，子宮内膜に特異的に発現していたものは7遺伝子であった．さらに，培養上皮細胞で発現が確認されたのは，BTC，MSTN，TGFB2およびPDGFBの4遺伝子であった．56遺伝子のうち，未だ受容体が明らかにされていない因子も存在し、そのうち子宮内膜に特異的に発現していた遺伝子はIGFBP5，MIAおよびOGNの3遺伝子であった．本研究において，遺伝子の網羅的な解析により伸長期胚に作用し得る遺伝子を特定した．. |
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山口勇人、藤原泰佑、山内伸彦, 着床期ウシ子宮内膜におけるGALNSの発現解析, 第111回日本繁殖生物学会, 2018.09, 【目的】妊娠初期のウシ子宮内膜の組織改変は着床や胎盤形成に必須な過程である。組織改変は細胞外マトリックス(ECM)の分解および再編成に基づいており、ECM分解酵素であるMMP(Matrix Metallopoteinase)が中心的に機能する事が報告されている。我々は、着床期の組織改変が伸長期胚から分泌されるインターフェロンタウ(IFNτ)の制御下にある可能性を報告している。既報では、I型IFNがウシ子宮内膜組織中に貯蓄されているMMPの放出を誘導することを報告した。また、MMPがグリコサミノグリカン鎖(GAG鎖)に結合して貯蓄されていると想定してGAG分解酵素の発現を解析し、スルファターゼであるN-アセチルガラクトサミン-6-スルファターゼ(GALNS)遺伝子の発現が着床期で上昇することを示した。これらの結果は、GALNSを介してIFNτがMMPの放出を制御している事を示唆するものである。本研究ではGALNSのタンパクレベルでの発現動態を明らかにすることを目的とした。【方法】黄体期および着床期のウシ子宮内膜におけるGALNSの局在を免疫組織化学的に検索し、ウェスタンブロット法により発現量を解析した。また、単層培養のウシ子宮内膜上皮細胞(BEE)と間質細胞(BES)を、IFNαで処理し、GALNSの発現量に対する影響を調べた。【結果及び考察】免疫組織化学的検索の結果、黄体期および着床期でGALNSの発現が認められ、BEEとBESにGALNSが局在していた。一方、タンパクの発現は黄体期と比較して着床期において有意に高い値を示した(P |
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黒木優美、高武亜衣、髙橋凛、山内伸彦, マトリゲルを用いたウシ子宮腺生体外モデルの構築, 第111回日本繁殖生物学会, 2018.09, 【背景と目的】反芻動物の伸長期胚の成長と生存には腺上皮産生因子が不可欠である事が示唆されているが、その具体的な機能や発現制御機構は未解明である。一方で、子宮腺機能を生体外で再現できる培養系は未だ確立されていない。そこで本研究では、腺上皮様構造を再構築できるマトリゲル内培養を用いてウシ子宮内膜上皮(BEE)の培養系を確立し、子宮腺産生因子の解析を行った。【方法】培養4日目のマトリゲル内培養下のBEEを用いて以下の実験を行った。①単層BEEと比較し、子宮腺特異的因子（SERPINA14、GRPおよびFOXA2）の遺伝子発現を解析した。②P4 (10-6M)、IFNα（100IU/ml）およびP4＋IFNα処理を行い、SERPINA14の遺伝子発現を解析した。③子宮内膜の機能発現には間質細胞とBEEの相互作用が重要であると報告されていることから、単層間質細胞の上に①と同様のBEEのマトリゲル内培養を行い、P4、IFNα及びP4＋IFNα処理後にSERPINA14の遺伝子発現を解析した。【結果】①単層培養BEEと比較し、マトリゲル内培養下BEEにおいてSERPINA14及びGRPの遺伝子発現が有意に高い値を示した(P |
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佐藤耀介， 野澤大志， 宗知紀、山内 伸彦, 小型野生ネコの保全を目的としたネコの尿および糞由来細胞の採取とその特性, 第2回野生動物保全繁殖研究大会, 2018.07, 小型野生ネコは希少種が多く、日本固有種であるツシマヤマネコ（Prionailurus bengalensis euptilurus）やイリオモテヤマネコ（Prionailurus bengalensis iriomotensis）も絶滅危惧種に指定されている。これらの種の保護・繁殖の取り組みは重要であるが、飼育下繁殖は難航しているのが現状である。そこで新たな人工繁殖の方法として体細胞クローン技術が期待されるが、絶滅危惧種においてはドナー細胞採取が非侵襲的に行われる必要がある。非侵襲的に採取したドナー細胞を用いた体細胞クローン動物の作出例として、尿由来細胞（Urine-derived cell、以下UDC）による体細胞クローンスイギュウ（Bubalus bubali）およびマウス（Mus musculus）の作出が報告されている。本研究では、UDCに加えて糞由来細胞（Fecal-derived cell、以下FDC）をドナー細胞の候補とし、近縁種のイエネコ（Felis catus）を用いてその基本的な特性を明らかにすることを目的とした。
福岡市動物愛護管理センターにてイエネコの去勢・避妊手術の際に尿および糞を採取した。生細胞数はトリパンブルー染色により計測した。尿サンプルは運搬時の温度を4℃または37℃に設定し、運搬後の生存率を調べた。UDCは採取した尿を遠心分離して回収した。FDCについては、糞の凍結切片を作製してHE染色を行い、まず糞中に細胞が含まれている事を確認した。さらに、糞をPBS/PVA中で静かに攪拌した後、遠心分離を行い上清を除去した。沈殿からDNAを抽出し、イエネコDNAの特異的配列に対するプライマーを用いてPCRを行った。
ネコ尿中に移行上皮細胞と扁平上皮細胞が確認でき、生細胞数の尿中平均濃度は移行上皮細胞が約337.8cells/ml、扁平上皮細胞が約6252.1cells/mlであった。輸送の温度条件は4℃における生存率が43.2％であったのに対し、37℃では66.1％であり、37℃の輸送における生存率が有意に高かった（pこれらの結果から、ネコの尿および糞から生細胞を採取できることが示された。今後は密度勾配遠心分離による生細胞の分離法を検討する。また、実際にイエネコ卵子を用いて体細胞核移植を行い、これらの細胞がクローン作製のドナー細胞として使用できる可能性を検証する。. |
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西野 要、高橋 凛、政家 裕典、山内 伸彦, ウシ子宮内膜上皮細胞の機能に対するIGF-1の効果
, 第124回日本畜産学会, 2018.03, 【【目的】我々は第122・123回日本畜産学会において、P4がウシ子宮内膜間質細胞のIGF-1遺伝子発現を促進し、さらにIGF-1がβカテニン（CTNNB）の発現を増加させる事を報告した。しかしながら、IGF-1の上皮細胞に対する効果は未だ不明な点が多く残されている。本研究では、ウシ子宮内膜上皮細胞（BEE）の機能に対するIGF-1の効果を明らかにすることを目的に、増殖活性および黄体期特異的遺伝子の発現に対する効果を調べた。
【方法】IGF-1は100ng/mlの濃度で添加した。細胞増殖活性は培養3日後の細胞数を測定し対照区と比較した。また、CTNNBの発現とその上流因子であるGSK3βのリン酸化状態をウエスタンブロッティングにて調べた。さらに、黄体期で特異的に発現する遺伝子であるALDOA、TXN、SLC2A1およびBCL2の発現に対する効果をRT-qPCRによって調べた。
【結果】BEEの増殖活性はIGF-1添加により有意に増加した。また、CTNNBの発現が有意に増加するとともに、GSK3βのリン酸化も促進された。さらに、SLC2A1およびBCL2の発現を促進した。これらの結果はIGF-1がBEEのCTNNB発現を増加させるだけでなく、増殖活性および黄体期特異的遺伝子の発現を制御している可能性を示唆するものである。. |
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政家 裕典、西野 要、高橋 凛、高橋 秀之、山内 伸彦, 胚性分泌因子 MIF による着床期ウシ子宮内膜の遺伝子発現制御
, 第124回日本畜産学会, 2018.03, 【目的】反芻動物の妊娠成立にはIFNtが妊娠認識物質として大きな役割を担っていることが報告されている。一方で、IFNtとは異なる他の胚性分泌因子が遺伝子機能を制御する可能性が示唆されている。本研究では、ウシ伸長期胚が産生する因子の同定とその受容体および下流因子の遺伝子発現制御について解析を行った。【方法】ウシ伸長期胚培養上清のLC-MS/MS解析および着床期子宮内膜発現遺伝子のRNA-Seq解析の結果から、IFNt以外の胚性分泌因子としてマクロファージ遊走阻止因子(MIF)に着目した。まず、MIF受容体の遺伝子発現と、その発現に対するI型IFNの効果を解析した。次に、MIFの下流因子として推定された遺伝子(ARG1、CCL2、IL7、IL23A)の発現に対するIFNおよびMIFの効果を解析した。【結論】MIF受容体は胚では発現していなかったが、子宮内膜上皮細胞(BEE)、単核球(PBMC)および多形核白血球(PMN)における発現が認められた。また、BEEおよびPMNにおいてIFNによりMIF受容体の遺伝子発現が上昇し(P＜0.05)、下流因子のCCL2はIFN+MIFにより遺伝子発現が上昇した(P＜0.05)。本研究において新たな胚性分泌因子としてMIFを特定した。また、MIF単独では遺伝子発現に対する効果が認められなかったことから、IFNtとの共作用により着床期に重要な機能を持つことが示唆された。. |
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Taisuke Fujihara, Seiya Yamashita, Kaname Nishino, Md. Rashedul Islam, Nobuhiko Yamauchi, Regulation of MMPs via type I interferon in the bovine endometrium during implantation stage, 4th World Congress of Reproductive Biology, 2017.09, Introduction
Evidence suggests that matrix metalloproteinases (MMPs) play important role in bovine endometrium tissue remodeling. Previous studies in our laboratory reported that type I interferon (IFN) encourages the release of accumulated MMPs in the endometrium. However, the detail of its regulatory mechanism is still unknown. Recent findings revealed that MMPs bind to glycosaminoglycan (GAG) and accumulate in tissues. Therefore, in our study we focused on GAG degrading enzymes whose expression is fostered in the endometrium by type I IFN.
Materials and Methods
GAG degrading enzymes with significantly higher gene expression at implantation stage were analyzed using RNA-sequence data obtained from bovine endometrium. The effect of GAG degrading enzymes (heparitinase and hyalronidase) on release of MMPs was analyzed by zymography. Further, gene expression in stromal cells, epithelial cells and hetero spheroids was analyzed by real time quantitative polymerase chain reaction.
Results and Discussion
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We found that galactosamine (N-acetyl)-6-sulfatase (GALNS) gene significantly increased at implantation stage. Likewise IFN alpha, both the GAG degrading enzymes upheld the MMPs release from the hetero spheroids. IFN alphaα promoted the GALNS gene expression in hetero spheroids and stromal cells. These results suggest that MMPs binds to GAGs and accumulated in tissues are released by GALNS whose expression is induced by type I IFN and resulted in tissue remodeling of the bovine endometrium during implantation stage.. |
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野澤大志,佐藤耀介,宗知紀,山内伸彦, ネコ卵子の体外成熟および単為発生に及ぼす要因の検索, 第123回日本畜産学会, 2017.09, イエネコ卵子は実験動物や家畜の卵子に比べて基礎的な生理学的特性に関する情報が非常に少ない。またネコ卵巣のドナーは年齢や生育環境が様々であり、卵巣ドナーとなるネコを選択することは難しい。そこで本研究では、ネコ卵子についての基礎的な情報を得る事を目的に、様々な要因が卵子の成熟培養に及ぼす影響、およびその後の単為発生の条件検討を行った。 避妊手術の際に得られた卵巣を4℃または35℃で保存し実験室まで輸送した。卵巣切開法によって卵丘卵子複合体を採取し成熟培地中で24時間培養(38℃, 5%CO2)した。培養後卵丘細胞を除去し、第二減数分裂中期に達した卵子に電気刺激による単為発生処理を行い、電圧の強さと刺激回数が分割率に及ぼす影響について検証した。 ネコ卵巣輸送時の温度は、4℃の冷却条件における卵子の成熟率が有意に高い値を示した(48.5% vs 18.5%)。ネコは5ヵ月頃から性成熟を開始するため、4ヵ月齢以下の未成熟ネコと5か月齢以上の成熟ネコ、それぞれの卵巣由来卵子の成熟率を比較したところ、成熟ネコ由来卵子の成熟率が有意に高い値を示した(68.2% vs 13.5%)。単為発生処理では、200V×1回および50V×3回の条件で電気刺激を行う事で約70%の分割率が得られた。以上の結果はネコ卵子の基本的な生理的特性を明らかにするものであり、ネコクローン胚の効率的な作製に寄与するものである。. |
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西野要,政家裕典,高橋凛,山内伸彦, ウシ子宮内膜におけるβカテニンの局在と制御機構の解明, 第123回日本畜産学会, 2017.09, 【目的】βカテニン（CTNNB）は細胞間接着と遺伝子の転写活性に関与する細胞内タンパク質であり、子宮機能において重要な役割を担うと考えられている。しかし、ウシ子宮内膜における時期特異的な局在、およびその機能を制御する上流因子については未だ明らかでない。本研究では、ウシ子宮内膜におけるCTNNBの局在と制御機構を解明することを目的とした。【方法】卵胞期、黄体期および着床期の子宮小丘の凍結切片を作成し、CTNNBの局在を免疫組織化学的手法により解析した。また、間質細胞で制御因子が産生されると想定し、培養ウシ子宮内膜間質細胞におけるCTNNBの上流因子候補（IGF1、WNT2、FZD1およびLRP6）の遺伝子発現をRT-qPCRにより解析した。さらにリコンビナントIGF1をウシ子宮内膜上皮細胞に添加し、CTNNBのタンパク質量と細胞内局在をウェスタンブロッティングと免疫染色を用いてそれぞれ解析した。【結果】CTNNBは卵胞期では細胞膜および細胞質に局在していたが、黄体期と着床期では核内にも局在していた。この結果から、黄体期および着床期においてCTNNBが転写活性に関与する可能性が示唆された。また、上流因子の遺伝子発現解析では、P4添加によりIGF1遺伝子の発現のみが有意に上昇した（P＜0.05）。リコンビナントIGF1を用いた解析結果も併せて報告する。
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高武亜衣,諌山慧士朗,山内伸彦, マトリゲル内培養におけるウシ子宮内膜上皮細胞の子宮セルピン発現, 第123回日本畜産学会, 2017.09, 【目的】伸長期胚の成長と生存には腺上皮細胞が産生する子宮セルピン（SERPINA14）の発現が重要である事が示唆されている。しかし、その発現制御機構や具体的な機能は未だ不明な点が多く残されている。本研究では、腺上皮様構造を再構築できるマトリゲル内培養を用いてウシ子宮内膜上皮（BEE）の培養系を確立し、SERPINA14の発現制御機構の解明を目的とする。【方法】ウシ子宮内膜のRNASeq解析よりSERPINA14の発現は着床期において有意に高い値を示した。この結果から、SERPINA14の発現はプロジェステロン(P4)およびインターフェロン・タウ(IFNτ)の制御下にあることが想定された。よって、培養5日目のゲル内培養下BEEにP4 (10-6M)24ｈ処理、およびIFNα（100IU/ml）6ｈ処理を行い、SERPINA14の遺伝子発現をreal time-qPCRにて解析した。【結果】ウシ小丘間組織におけるreal time-qPCR解析結果より、SERPINA14は黄体期と比較し着床期で有意に高い値を示した(P= 0.0008)。マトリゲル内培養の全ての実験区においてBEEは楕円形の腺様構造を形成した。しかし、SERPINA14遺伝子の発現はP4処理(P=0.91)およびIFNα処理（P=0.53）において対照区と比較し有意な差は認められなかった。子宮内膜の機能発現には間質細胞とBEEの相互作用が重要であると報告されていることから、BEEは間質細胞との共培養を行う必要が示唆された。. |
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藤原泰佑, 山下聖世, 山内 伸彦, 着床期ウシ子宮内膜におけるI型IFNを介したMMPsの制御機構, 第122回日本畜産学会, 2017.03, 【目的】着床期ウシ子宮内膜における組織改変にはMMPsが関与することが示唆されている。我々は第117回大会にて、MMPsが子宮内膜組織中に蓄積され、I型IFNによって組織からの放出が促進される事を報告したが、その制御機構の詳細は未だ不明である。MMPsは組織中のグリコサミノグリカン(GAG)に結合して蓄積されることが報告されている。そこで本研究では、I型IFNによって子宮内膜で発現が促進されるGAG 分解酵素の探索を行った。【方法】ウシ子宮内膜におけるRNA-Seq解析により、着床期で有意に遺伝子発現が上昇したGAG 分解酵素を探索した。さらに、間質細胞、上皮細胞およびヘテロスフェロイドにおける遺伝子発現をRT-qPCRにて解析した。また、GAG分解酵素であるヘパリチナーゼを用い、MMPの放出に対するGAG分解酵素の影響を解析した。【結果】RNA-Seq解析によりスルファターゼであるGALNSが着床期で有意に上昇し、IFNαによりヘテロスフェロイドと間質細胞において遺伝子発現が促進された。また、ヘテロスフェロイドのMMP放出に対するヘパリチナーゼの影響では、IFNα添加時と同様に培養上清中にMMPsが放出された。これらの結果から、組織中のGAGに蓄積されたMMPsはI型IFNにより発現が誘導されるGALNSによって放出され活性化し、着床期ウシ子宮内膜における組織改変を引き起こすことが示唆された。
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高橋凛, 高武亜衣, 西野要, 政家裕典, 山内 伸彦, ウシ子宮内膜間質細胞におけるプロジェステロン誘導性因子の探索, 第122回日本畜産学会, 2017.03,
○髙橋凜, 髙武亜衣, 西野要, 政家裕典，山内伸彦(九大院農)
【目的】黄体期・着床期におけるウシ子宮内膜上皮細胞(BEE)の機能はプロジェステロン(P4)により制御されていると考えられている。一方で、BEEにおけるP4受容体の発現はP4自身によって抑制されており、P4によるBEE機能の制御機構は未だ不明な点が残されている。本研究では、P4がウシ子宮内膜間質細胞(BES)を介してBEEの機能を制御していると想定し、P4によるBEE機能制御機構の解明を目的にBESにおけるP4誘導性因子の探索を行った。【方法】ウシ子宮内膜RNA-seq解析の結果から黄体期で発現が上昇している因子に着目し、GO解析により細胞間コミュニケーションを担う可能性のあるサイトカインおよび成長因子を探索した。これらの因子について、培養BEEおよびBESにおける発現をRT-PCRにより解析した。【結果】ウシ子宮内膜において1671個の遺伝子が卵胞期より黄体期で有意に高い発現を示し、GO解析により2個のサイトカイン(GDF10, IL15)と6個の成長因子(BTC, FGF13, GDF10, IGF1, PDGFA, PGF)が同定された。BTCはBEE、IGF1はBES、 IL15, FGF13, PDGFAは BEEとBESの両方でそれぞれ遺伝子が発現していた。遺伝子発現に対するP4の影響についても併せて報告する。
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政家裕典, 西野要, 高橋凛, 山内 伸彦, ウシ伸長期胚が産生するサイトカインおよび成長因子の解析, 第122回日本畜産学会, 2017.03, ウシ伸長期胚が産生する因子としてIFNTが母体の妊娠認識や着床過程に不可欠であることが報告されているが、他の因子の解析はほとんど行われていない。本研究では、着床期の子宮内膜機能を制御する因子の探索を目的として、伸長期胚が産生する因子の同定とその受容体の解析を行った。【方法】妊娠18日目のウシ伸長期胚培養上清中のタンパク質をLC-MS/MSにより同定した。これらのタンパク質の中からサイトカインおよび成長因子に着目し、胚と子宮内膜における遺伝子発現をRT-PCRにより解析した。次に、ウシ子宮内膜のRNA-Seq解析結果からIPA解析により着床期子宮内膜で発現が上昇する遺伝子の上流因子の解析を行った。【結論】ウシ伸長期胚培養上清から6個のサイトカイン（IFNT, IFN-tau-c1, FAM3C, MYDGF, AIMP1, MIF）と2個の成長因子（GRN, HDGF）が特定された。これらの因子は、IFNT以外の全ての因子の遺伝子が子宮内膜でも発現していた。IPA解析の結果、IFNT に加えてMIF（マクロファージ遊走阻止因子）が制御していると想定される遺伝子の発現が着床期子宮内膜で上昇した（P＜0.05）。MIFの受容体であるCD74の遺伝子は胚では発現しておらず、着床期子宮内膜で発現が上昇した（P＜0.05）。これらの結果から、IFNT の他に、胚の産生するMIFが着床期子宮内膜機能を制御している可能性が示唆された。. |
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Md. Rashedul Islam, 吉井裕香, 池口祐子, 山内 伸彦, Early implantation in vitro as revealed by co-culture of embryos and cultured uterine explants, 第109回日本繁殖生物学会, 2016.09, Although a number of studies describe the in vitro co-culture model, still the positioning of embryos to the uterine lumen and examination of blastocysts attached to the endometrial tissue was not so easy due to the small size of blastocysts compared to the endometrial tissues. The current study was aimed to develop an in vitro co-culture system to study the early implantation. Rat uterine explants (1-2 mm) were isolated, cultured and further characterized. Then morphologically normal embryos were flushed from uterine horns and hatching was induced by Acidic Tyrode’s solution (pH-2.5) for 15-30 second to remove the zona pellucida. Individual hatched blastocyst and cultured explant was placed in a 96U well plate. Results showed that stable attachments were observed after 48 hours of co-culture, where embryos were stably attached to the explants and could not be dislodged after mild shaking and/or pipetting. Furthermore, steroid hormones are critical for endometrial receptivity and further implantation process. The steroid hormone treatment revealed that the rate of attachment of embryos to the explants were significantly increased in P4 treated group (63.63%) compared to the control or non-treated group (35.48%). On the other hand, attachments of embryos to the explants were significantly reduced in E2 treated group compared to the control group, where no stable attachments were observed in E2 treated group (0.0%). The study suggests that the co-culture model is suitable for the study of early implantation and steroid hormones influence the rate of attachment in this system.. |
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政家裕典, 山内 伸彦, ウシ伸長期胚が分泌するサイトカインおよび成長因子の検索, 第109回日本繁殖生物学会, 2016.09, 胚の発生や着床は胚と子宮内膜の相互作用によって制御された子宮内膜環境が重要である。これまでに様々な動物種において胚性分泌因子が着床における子宮受容能獲得に機能している可能性が示唆されているが、その具体的な因子は未だ明らかにされていない。そこで本研究では、着床期の子宮内膜環境を制御する胚性分泌因子の探索を目的とし、妊娠18日目のウシ伸長期胚が分泌するサイトカインおよび成長因子の検索を行った。【方法】妊娠18日目のウシ伸長期胚を無血清培地で24時間培養し、回収した上清中のタンパク質をLC-MS/MSにより同定した。NCBIのタンパク質 データベースを用いて同定されたタンパク質をコードする遺伝子に変換後、IPAを用いて子宮内膜機能を制御している可能性のあるサイトカインおよび成長因 子を特定した。また、これら遺伝子の伸長期胚と子宮内膜組織における発現をRT-PCRにより解析した。【結果】LC-MS/MSによりウシ伸長期胚の培養上清から1091個のタンパク質が同定された。遺伝子情報からIPAによる解析を行った結果 1059個の解析が可能であり、これらの中には細胞内に局在する因子が多く認められたため、Extracellular Spaceに分類された62個の因子を分泌因子として特定し た。これら分泌因子を機能別に分類したところ4個のサイトカイン(FAM3C, MYDGF, AIMP1, MIF)と2個の成長因子(GRN, HDGF)が特定された。IPAで解析できなかった32個の因子についてNCBIの遺伝子データベースを用いて機能別に分類したところ、2個のサイトカイ ン(IFNT, IFN-tau-c1)が特定された。これら因子の遺伝子発現をRT-PCRにより解析した結果、IFNTは従来の報告と同様に胚でのみ発現していたが、他の因子全てが胚と子宮内膜組織の両方で発現していることが示された。これらの結果から、今回同定された因子が着床期の胚または子宮内膜において機能を有する可能性が示唆された。. |
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池口祐子, Md. Rashedul Islam, 山内 伸彦, ラット子宮における線維芽細胞増殖因子受容体の発現解析, 第109回日本繁殖生物学会, 2016.09, 線維芽細胞増殖因子(FGF)は分化、増殖、血管新生などに関与する増殖因子のひとつであり、子宮においてもいくつかのFGFの発現が報告されている。FGF受容体(FGFR)は4種類から構成され、子宮内膜上皮-間質の細胞間相互作用に関与していると考えられている。子宮におけるFGFの機能を解明する上でFGFRの解析が必須となるが、これまでにその発現に関する報告は少ない。そこで本研究では、子宮におけるFGFシグナル系列の解明を目的にFGFRの発現動態の解析を行った。【方法】初めに子宮組織、培養子宮内膜上皮および間質細胞、培養子宮組織片それぞれにおけるFGFRの発現をRT-PCRにて解析した。次に子宮内膜で発現が確認されたFGFRについての解析を行った。性周期および妊娠初期の子宮におけるFGFRの発現動態を調べるために、子宮組織を用いReal-time qPCRにて解析を行った。【結果】RT-PCRの結果、妊娠3.5日子宮組織および培養子宮組織片では全てのFGFRの遺伝子発現が認められたが、培養子宮内膜上皮および間質細胞ではFGFR4の発現は認められなかった。これらの結果から子宮内膜の細胞間相互作用にはFGFR1,2,3が重要であり、FGFR4は筋層や血管内皮などで発現していることが示唆された。Real-time qPCRの結果、FGFR1 mRNAの発現は発情前期において有意に高い値を示し、その後の発情後期および初期妊娠期では発現が低下した。一方FGFR2 mRNAは着床前である妊娠3.5日に一過性の上昇を示し、以降は妊娠の進行とともに発現が減少した。FGFR3 mRNAは性周期および妊娠初期における発現の差は認められなかった。以上の結果からラット子宮では全てのFGFR遺伝子が発現しており、FGFR1およびR2のmRNAは性周期および初期妊娠期にその発現が変動することが明らかとなった。これらの結果は、子宮においてFGFRが時期特異的に発現して機能を有することを示唆するものである。. |
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Mohamed El-Sharawy, Asami Tanaka, Hikaru Suyama, M. R. Islam, 山内 伸彦, Effect of Cdc42 inhibitor on maturation rate of mouse cumulus and denuded oocytes during in vitro maturation, The 17th AAAP Animal Science Congress, 2016.08, Recent studies demonstrated that Cdc42 participated in asymmetric spindle orientation before polar body emission in mouse oocytes. Therefore, the study was aimed to investigate the effect of Cdc42 inhibitor (ML141) on maturation rate (MR) of mouse oocytes during in vitro maturation (IVM). Female mice (8–10 weeks old) were sacrificed by cervical dislocation after 46 hours of equine Chorionic Gonadotrophin (eCG; 5 IU) administration and ovaries were placed in M2 medium supplemented with 5 mg/ml bovine serum albumin. Cumulus and denuded oocytes (COC and DO) were collected and placed in M2 medium. Germinal vesicle (GV) oocytes were cultured in M16 media with 5μl/ml DMSO as control and 100μM from ML141 as treatment under mineral oil at 37°C with 5% CO2. ML141 was dissolved in 0.5% v/v DMSO and added to maturation medium to give a final concentration of 100 μM. For the analysis of MR, oocytes were observed to determine different stages of oocytes as GV, germinal vesicle breakdown, metaphase I, metaphase II, oocytes with big polar body (BPB) and degenerated oocytes.
Results of this study showed a significant difference (P. |
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S.A.A. Musavi, H. Masaka, M. R. Islam, 山内 伸彦, KOSUKE TASHIRO, Differential gene expression analysis in bovine uterus at follicular, luteal and implantation stage
, The 17th AAAP Animal Science Congress, 2016.08, In mammalian reproduction, uterine modulation is important for embryonic development, implantation and further placentation. This uterine modulation triggered by genes is not only steroids dependent but also the embryonic factors are critical during early pregnancy. Although the gene expression in uterus differs according to the reproductive cycles, the profiles of the functional genes yet to be identified. Therefore, the study was aimed to compare gene expressions of three different reproductive stages namely follicular, luteal and implantation in the bovine uterus. Bovine uteri were collected from the slaughterhouse and the follicular (n=5) and luteal stages (n=5) were defined by the morphology of the ovaries. For the uterus of implantation stages (n=5), cows were slaughtered on day 18 of pregnancy representing the conceptus elongation. Then the total RNA was extracted from endometrium tissues by using standard protocols of our laboratory and the quality was assessed by spectrophotometric UV absorbance at 260/280 nm. RNA was purified and used to prepare amplified cDNA, which was then subjected to high-throughput sequencing using HiSeq 2500 sequencer (Illumina). Genes were selected by the criteria of fold change, considering >2 and |
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M. R. Islam, Yuka Yoshii, Yuko Ikeguchi, 山内 伸彦, Development of an in vitro model to study uterine functions using in vitro cultured rat uterine explants, The 17th AAAP Animal Science Congress, 2016.08, Uterine functions reflect on implantation and further placentation is mediated by a variety of factors produced by the endometrium and the blastocyst. Hence, it is important to investigate the uterine characters to understand the complex process of uterine functions. In this regard, an in vitro model would be a promising alternative. Considering the above perspectives, the present study was aimed to develop an in vitro model using rat uterine explants to explore complex uterine functions.
Rat uterine explants (1-2 mm) were isolated, cultured and further characterized by phase contrast microscopy, histological analysis and indirect immunofluorescence staining. Then explants were treated with steroid hormones and the regulation of MUC1, PR, AREG and IGFBP1 were investigated. RT-qPCR data revealed that MUC1 and PR was upregulated significantly (PThe study revealed that the cultured uterine explants exhibited comparable characters of the in vivo uterine conditions, which suppose to mimic the morphology and physiology of the uterus. In conclusion, despite the necessity of comprehensive investigation, still the cultured rat uterine explants can be a useful in vitro model to explore endometrial functions.
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H. Masaka, S. A. A. Musavi, M. R. Islam, 山内 伸彦, Screening of embryo secreted factors using bovine elongated embryos, The 17th AAAP Animal Science Congress, 2016.08, It is suggested that some embryo-derived factors modulate the endometrial functions and play pivotal role in acquiring uterine receptivity. Thus the present was aimed to analyze proteins secreted from bovine elongated embryos to identify embryo-derived factors, those regulate endometrial function at implantation stage.
Bovine elongated embryos at day 18 of pregnancy were cultured in DMEM/Ham’s F12 containing 1μM P4 and 1% PVA for 24 hours. Then, harvested supernatants were analyzed by LC-MS/MS. A total of 1091 proteins were identified and out of those 1069 proteins were converted to genes by protein database in NCBI. Annotated 904 genes were analyzed by GO analysis and observed that proteins coded by these genes contain the factors; those were not secreted outside the cells, such as cytoskeleton. Therefore, the factors with signal peptide were searched again for the genes, and 159 factors were identified as secretory factors. In reference to gene database in NCBI, secretory factors were categorized for enzyme, cell adhesion molecules, proteinase, protein regulators, proteinase inhibitors, molecule transporters, receptors, cytokines, growth factors, transcriptional factors and others. Identified cytokines (IFNT, FAM3C) and growth factors (MANF, GRN, MYDGF) were focused, as they have the possibility to become functional in signaling between embryo and endometrium. The gene expression of cytokines and growth factors in embryos and endometrium at the day 18 of pregnancy was analyzed by RT-PCR. The result showed that IFNT was expressed only in embryos (as observed in previous studies), while other genes were expressed both in embryos and endometrium.
However, no remarkable number of embryo specific factors could screen except IFNT, but the remaining genes might be a promising pool to screen the embryo specific factors. Thus, further study is necessary to analyze the factors by using IPA to sum up the embryo specific factors.. |
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西野要, 藤原泰佑, Md. Rashedul Islam, 山内 伸彦, ウシ子宮内膜におけるβ-cateninの発現解析, 第121回日本畜産学会, 2016.03, 【目的】β-catenin（CTNNB1）はカドヘリンと複合体を形成して細胞接着に関与するとともに、核内へ移行して転写制御に関わることで、子宮機能に重要な役割を担うと考えられている。しかしながら、ウシ子宮内膜におけるCTNNB1の発現動態およびその制御については未だ明らかでない。我々は日本畜産学会第119回大会においてFGF9がウシ子宮内膜上皮細胞（BEE）のCTNNB1 mRNA発現を促進することを報告した。. |
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高武亜衣, 諫山慧志郎, Md. Rashedul Islam, 藤原泰佑, 山内 伸彦, ウシ子宮内膜上皮細胞のマトリゲル三次元培養, 第121回日本畜産学会, 2016.03, 【目的】子宮内膜上皮細胞はその局在から腔上皮と腺上皮（GE）に分けることができ、それぞれが子宮機能に重要な役割を担っていることが報告されている。GEは妊娠の確立と維持を担う子宮分泌物の主要な産生組織であり、ウシでは胚の伸長と着床において重要な役割を果たすと考えられている。着床におけるGEの機能解析は、着床メカニズムの解析に必要であると考えられる。そこで本研究では、ウシ子宮内膜上皮細胞(BEE)のゲル内三次元培養を行い、GEの生体外モデルの確立を試みた。. |
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諫山慧志郎, 高武亜衣, 山内 伸彦, ウシ子宮内膜上皮細胞におけるRNA干渉法を用いたFOXA2の機能解析, 第121回日本畜産学会, 2016.03, 子宮内膜上皮細胞はその局在から腔上皮と腺上皮(GE）に分別され、それぞれが子宮機能に重要な役割を持つ。GEは妊娠および胚発生に重要な子宮乳を分泌することが報告されている。げっ歯類子宮では転写因子Forkhead box A2(FOXA2）がGE特異的に発現し、子宮腺の形成・機能に必要な因子であると考えられている。我々はウシFOXA2について、GE特異的に発現すること、また発情周期・着床期における発現動態を報告した。しかしながら、ウシFOXA2の上皮細胞における機能は不明である。. |
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田中愛咲実, 陶山晃, 山上 一樹, 江頭昭義, 蔵本武志, 山内 伸彦, マウスの胎仔線維芽細胞および卵母細胞に対するCdc42抑制の影響, 第33回日本受精着床会, 2015.11. |
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山上 一樹, 吉井裕香, Md. Rashedul Islam, 山内 伸彦, 胚由来因子による着床期ラット子宮遺伝子の発現調節, 第33回日本受精着床会, 2015.11. |
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吉井裕香, 山上 一樹, Md. Rashedul Islam, 山内 伸彦, ラット子宮におけるSulf1の発現および局在の解析, 第108回日本繁殖生物学会, 2015.09. |
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陶山晃, 田中愛咲実, 山上 一樹, 江頭昭善, 蔵本武志, 山内 伸彦, 染色体制御因子KidおよびCdc42抑制による多核化とアポトーシス誘導の関係, 第108回日本繁殖生物学会, 2015.09. |
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Md. Rashedul Islam, 山上 一樹, 吉井裕香, 山内 伸彦, In Vitro Culture of Rat Uterine Explants: Characterization, Hormonal Regulation and In Vitro Decidualization, 第108回日本繁殖生物学会, 2015.09. |
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藤原泰佑, 山下聖世, 山上一樹, 田中綾, 山内 伸彦, ウシ子宮内膜におけるカテプシン遺伝子の発現解析, 第120回日本畜産学会, 2015.09, 【目的】着床や胎盤形成の際に生ずる子宮内膜の組織改変には、様々なプロテアーゼが関与している。カテプシン(CTS)はECMや細胞内のタンパクの分解に機能し、げっ歯類やヒツジにおいて着床前の子宮内膜で発現していることが報告されているが、その詳細は未だ明らかでない。本研究では、ウシ子宮内膜におけるCTSの遺伝子発現とその機能を調べることを目的とした。【方法】卵胞期、黄体期、着床期のウシ子宮内膜小丘組織におけるCTS A、B、G、KおよびLの遺伝子発現をRT-qPCRによって調べた。また、ウシ子宮内膜ヘテロスフェ. |
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山上一樹, Md. Rashedul Islam, 吉井裕香, 山内 伸彦, Preimplantation embryo-secreted factors modulate maternal gene expression in rat uterus., Society for the Study of Reproduction, 48th Annual Meeting, 2015.06. |
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山下聖世, 藤原泰佑, 田中綾, Md. Rashedul Islam, 山内 伸彦, Type I interferon regulates Matrix Metalloproteinases (MMPs) expression of the bovine endometrial cells in vitro., Society for the Study of Reproduction, 48th Annual Meeting, 2015.06. |
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田中綾, 山下聖世, 藤江周一郎, 藤原泰佑, 山内 伸彦, 服部 眞彰, ウシ子宮内膜上皮細胞に対するFGF9の影響, 第118回日本畜産学会, 2015.03, 【目的】ウシ子宮内膜上皮細胞（BEE）はエストロジェン（E2）の直接的な影響下にあることが知られているが、プロジェステロン（P4）濃度が高い黄体期や妊娠期においても子宮機能に重要な役割を持っている。しかしながら、黄体期や着床期ではBEEでP4レセプターの発現が減少することから、P4が直接BEEへ作用するのでなく、子宮内膜間質細胞（BES）で産生された分泌性因子によって間接的に制御されることが考えられる。我々は第7回日本暖地畜産学会宮崎大会において、P4がBESにおけるFGF9の発現を誘導することを報告した。そこで本研究では、BEEに対するFGF9の影響を明らかにするために、その遺伝子発現について解析を行った。【方法】血中P4濃度が低い卵胞期と、高い黄体期および着床期のウシ子宮小丘からmRNAを抽出し、定量RT-PCR法を用いて各時期におけるFGF9下流候補因子の遺伝子発現を比較した。またBEEの培養上清中にリコンビナント FGF9を添加し、候補因子の遺伝子発現を同様に解析した。【結果】卵胞期と比較し、黄体期および着床期ではFGF9下流候補因子であるTIMP2、ITGB5およびLGMNの遺伝子発現が有意に高かった（P＜0.05）。培養系におけるBEEに対するFGF9の影響についての解析結果も併せて報告する。
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山下聖世, 山上一樹, 田中綾, 藤原泰佑, 山内 伸彦, 服部 眞彰, ウシ子宮内膜ヘテロスフェロイドを用いたMMP制御機構の解明, 第118回日本畜産学会, 2015.03, 【目的】着床期ウシ子宮内膜における組織改変にMMPsが関与していることが示唆されているが、その制御機構については未だ解明されていない。本研究では、MMPsの制御メカニズムに対するI型インターフェロン（IFN）の影響を調べるため、三次元培養塊であるウシ子宮内膜ヘテロスフェロイドを用いた解析を行った。【方法】E2、P4、IFNαおよび伸長期胚培養上清を添加した培地でヘテロスフェロイドを24時間培養後、培養上清およびスフェロイドをゼラチンザイモグラフィーにて解析し、MMP2およびMMP9の発現を無添加の対照区とそれぞれ比較した。また、数種類のプロテアーゼ阻害剤を用いて、MMPs放出に関与する因子をスクリーニングした。【結果】IFNτを含有すると考えられる伸長期胚の上清添加によりMMP発現が増加した。さらにIFNα添加により同様の結果が得られたことから、Ⅰ型IFNが着床期におけるMMPの制御を行っていることが示唆された。また、セリンプロテアーゼ阻害剤により、これらMMPsの発現が抑制された。これらの結果から、着床期ウシ子宮内膜における組織改変にMMP2およびMMP9が関与し、I型IFNがセリンプロテアーゼを介して子宮内膜組織内部のMMPs動態を制御していることが示唆された。. |
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M. R. Islam, K. Yamagami, Y. Yoshii, 山内 伸彦, 服部 眞彰, Effects of Epidermal Growth Factor and Hepatocyte Growth Factor on Rat Endometrial Epithelial Cells Proliferation, Migration and Lumen Formation In Vitro, The 16th AAAP Animal Science Congress, 2014.11, ABSTRACT: Several growth factors such as epidermal growth factor (EGF) and hepatocyte growth factor (HGF) modulate the function of the rat endometrium and are reportedly acts on various epithelial cells. The present study examined the expression of each receptors, EGFR and c-Met mRNA in cultured rat endometrial epithelial cells (REE) as well as investigated the biological effects of EGF and HGF on REE. Furthermore the effects of EGF and HGF on cell cycle regulation (emphasizing on p53 and cyclin D) were also investigated.
The isolated and cultured REE were characterized by immunocytochemistry using endometrial epithelial cell specific antibodies. The expression of EGFR and c-Met mRNA in cultured REE were observed by isolation and purification of total mRNA followed by RT-PCR. Furthermore, the biological role of EGF and HGF on the regeneration of the endometrium was also studied in REE in their proliferative stage by using MTT assay. In the proliferation assay, the addition of EGF and HGF showed mitogenic effect in a dose dependent manner. Additionally, in vitro cell migration assay revealed that cell migration stimulated with the doses of EGF and HGF. The REE formed cell clusters followed by epithelial lumen formation were also prompted by EGF and HGF which were further investigated using a three-dimensional cell culture system. Furthermore the effect of EGF and HGF on cell cycle regulation (emphasizing on p53 and cyclin D) investigated by using real time quantitative PCR revealed that the cell cycle regulation was influenced by the EGF and HGF as did earlier.
Thus the current study suggest that the EGF and HGF deserve the stimulatory function as well as trigger the cell cycle regulation and thus both have the role in proliferation, migration and lumen formation of rat endometrial epithelial cells in primary culture in vitro.
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K. Yamauchi, 山内 伸彦, K. Yamagami, S. Yamashita, M. R. Islam, Shoji Tabata, K. Yahiro, T. Tamura, 服部 眞彰, Development of an in vitro model for the analysis of bovine endometrium using Micro Sphere Array, The 16th AAAP Animal Science Congress, 2014.11, ABSTRACT: The present study was conducted to develop an in vitro model for the analysis of bovine endometrial functions in a simple and easy method. We developed the hetero-spheroid as a model, consisting of bovine endometrial epithelial cells (BEE) and stromal cells (BES) using Micro Sphere Array® (MSA). MSA (STEM Biomethod Corporation, Kitakyushu, Japan) is a three-dimensional cell culture device, which has non-adherent cell culture wells.
BEE and BES were mixed in an appropriate density and were seeded immediately on a MSA. Followed by seeding cells were cultured for 3 days and it was noticed that the cells in each well of the MSA gradually aggregated and finally formed a multicellular mass. After 4 days of the culture, transparent cells covered the outer layer of the cell mass and finally formed a hetero-spheroid. Immunocytochemical analysis showed that the outer layers of the spheroids were covered with epithelial cells and stromal cells were positioned in the inner part of the spheroids. The hetero-spheroids expressed ERα, PR, IFNR-1 and IFNR-2 mRNA, detected by RT-PCR. Reactivity to steroid hormones was investigated by the addition of E2 and P4 to each culture medium. Results of real-time RT-PCR showed that PR and Oxytocin R mRNA were increased by the addition of E2, and HGF mRNA was increased by P4. Gelatin zymography showed that MMP production was suppressed in the hetero-spheroids.
In conclusion, we developed an in vitro model of the bovine endometrium, which could easily make in a short period. Since hormonal reaction and MMP production were similar to the character of endometrium in vivo, it was suggested that both models are effective for analysis of the endometrial functions in vitro. Thus, the hetero-spheroids developed in the present study provide a new platform for the bovine endometrial function research.
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田中 綾, 山下聖也, 藤江周一郎, 藤原泰佑, 山内 伸彦, 服部 眞彰, ウシ子宮内膜におけるプロジェステロン誘導性分泌性因子の検索
, 第７回日本暖地畜産学会, 2014.10. |
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田中 愛咲実, 山上 一樹, 江頭昭義, 蔵本 武志, 山内 伸彦, 服部 眞彰, マウス胎仔線維芽細胞における染色体分配制御因子 Kid および Cdc42 の発現と機能解析 , 第107回日本繁殖生物学会, 2014.08. |
| 52. |
藤江 周一朗, 山下 聖世, 中村 暢寿, 山内 伸彦, 服部 眞彰, ウシ子宮内膜におけるIndian Hedgehogの発現とその制御
, 第107回日本繁殖生物学会, 2014.08. |
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山上一樹, 山内啓介, 山下聖世, 山内 伸彦, 服部 眞彰, 着床遅延ラット子宮における胚性シグナル応答遺伝子の網羅的検索, 第118回日本畜産学会, 2014.03. |
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諌山慧士郎, 趙立佳, 田崎広天, 山内 伸彦, 服部 眞彰, ウシ子宮内膜細胞におけるPTGS2発現は時計遺伝子NR1D1によって抑制される, 第118回日本畜産学会, 2014.03. |
| 55. |
熊澤 真琴, 陳 華濤, 山内 伸彦, 服部 眞彰, プロラクチンは卵巣顆粒膜細胞の時計遺伝子Per2の振動的な発現を低下させプロジェステロン生成を抑制する
, 第106回日本繁殖生物学会, 2013.09. |
| 56. |
山上一樹, 山内啓介, 山下聖世, 山内 伸彦, 服部 眞彰, 着床期ラット子宮内膜の遺伝子発現における胚の影響
, 第106回日本繁殖生物学会, 2013.09. |
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山下聖世, 山内 啓介, 山上 一樹, 藤江周一朗, 山内 伸彦, 服部 眞彰, ウシ子宮内膜ヘテロスフェロイドを用いたMMPの発現解析, 第117回日本畜産学会, 2013.09. |
| 58. |
山内啓介, 山上一樹, 山下聖世, 田中綾, 山内伸彦, 服部眞彰, ウシ子宮内膜組織片の培養とその特性, 第117回日本畜産学会, 2013.09. |
| 59. |
細迫 岳人, 山上 一樹, 中村 暢久, 山内 啓介, 山下 聖世, 山内 伸彦, 服部 眞彰, ウシ子宮内膜におけるFoxa2の局在と発現動態, 第116回日本畜産学会, 2013.03. |
| 60. |
K. Yamagami, N. Nakamura, K. Yamauchi, S. Yamashita, K. Kubota, 山内 伸彦, 服部 眞彰, Expression and Regulation of Foxa2 in the Rat Uterus, The 15th AAAP Animal Science Congress, 2012.11. |
| 61. |
N. Nakamura, K. Isayama, K. Yamauchi, S. Yamashita, K. Yamagami, K. Kubota, 山内 伸彦, 服部 眞彰, Expression and Regulation of Indian Hedgehog in the Bovine Endometrium, The 15th AAAP Animal Science Congress, 2012.11. |
| 62. |
山内 啓介, 中村 暢寿, 山下 聖世, 田村 朋子, 八尋 寛司, 山内 伸彦, 服部 眞彰, マイクロスフェアアレイを用いたウシ子宮内膜スフェロイドの構築とその特性, 第105回日本繁殖生物学会, 2012.09. |
| 63. |
中村暢久 ・諌山慧士朗・山内啓介・山内伸彦 ・服部眞彰, ウシ子宮内膜におけるIndian Hedgehogの発現とその制御, 第115回日本畜産学会, 2012.03. |
| 64. |
中村 暢寿，諌山 慧士朗，合原崇文，山内啓介，田崎広天，山内 伸彦，服部 眞彰
, ウシ子宮内膜におけるIndian Hedgehog の発現, 第４回日本暖地畜産学会, 2011.10. |
| 65. |
西村 翔，中村 暢寿，諌山 慧士朗，山内 伸彦，服部 眞彰, ウシ子宮内膜スフェロイドを用いた生体外着床モデルの構築, 第104回日本繁殖生物学会, 2011.09. |
| 66. |
Nobuhiko Yamauchi, Kazuyoshi Hashizume, Masa-aki Hattori, Development of the Endometrial Spheroids as a Model for Implantation In Vitro, International Meeting for Evolution of Reproductive Biology and Task of Frontiers, 2011.09. |
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山上 一樹、合原崇文、西村翔、久保田海雄、宗 知紀、山内 伸彦、服部 眞彰, ラット子宮におけるFoxa2の時期特異的な発現および局在 , 第103回日本繁殖生物学会, 2010.09. |
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西村 翔 ・諌山 慧士郎 ・久保田 海雄 ・山中 賢一 ・ 高橋 ひとみ ・宗 知紀 ・木崎 景一郎 ・山内 伸彦 ・高 橋 昌志 ・橋爪 一善 ・服部 眞彰, ウシ子宮内膜由来細胞におけるI型IFN受容体遺伝子の発現 , 第112回日本畜産学会, 2010.03. |
| 69. |
久保田 海雄 ・合原 崇文 ・西村 翔 ・宗 知己 ・山中 賢一 ・木崎 景一郎 ・山内 伸彦 ・高橋 昌志 ・橋爪 一 善 ・服部 眞彰, ウシ子宮内膜におけるインディアンヘッジホッグ遺伝子の発現, 第112回日本畜産学会, 2010.03. |
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| 71. |
山上 一樹，久保田 海雄，宗 知紀，山内 伸彦，服部 眞彰, 着床期ラット子宮におけるFoxa2の発現 , 第102回日本繁殖生物学会, 2009.09. |
| 72. |
久保田 海雄，山上 一樹，山中 賢一，高橋 昌志，宗 知己，山内 伸彦，服部 眞彰, ラット子宮におけるIndian hedgehogの発現制御機構 , 第102回日本繁殖生物学会, 2009.09. |
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久保田海雄、松本健二、渡辺諒、山上一樹、宗知紀、山内伸彦、高橋昌志、服部眞彰, 妊娠初期ラット子宮におけるIndian hedgehogによる子宮内膜の制御, 第110回日本畜産学会, 2009.03. |
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久保田海雄・松本健二・渡辺諒・山上一樹・宗知紀・山内伸彦・服部眞彰, 妊娠初期ラット子宮におけるIndian hedgehogによる子宮内膜間質細胞の制御, 第101回日本繁殖生物学会, 2008.09. |
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西村享平・蒲生徹・宗知紀・山内伸彦・服部眞彰, ラット子宮における一酸化窒素合成酵素の発現, 第104回日本畜産学会, 2005.03. |
| 100. |
蒲生徹・西村享平・宗知紀・山内伸彦・服部眞彰, ラット子宮内膜間質細胞に対するTumor Necrosis Factor-αの影響, 第104回日本畜産学会, 2005.03. |
| 101. |
蒲生徹・西村享平・小島リンコン幹児・宗知紀・山内伸彦・服部眞彰, ラット子宮内膜由来細胞の分離と特性, 第97回日本繁殖生物学会, 2004.09. |
| 102. |
Nobuhiko Yamauchi, Kouichi Ushizawa, Toshihiro Konno, Chandana B Herath, Kazuyoshi Hashizume, Separation and Characterization of Bovine Placental Mesenchymal Cells In Vitro, Society for the Study of Reproduction, 36th Annual Meeting, 2003.06. |
