Language：English   Publisher：Nature Structural and Molecular Biology  

Eukaryotic translation initiation factor (eIF)4A—a DEAD-box RNA-binding protein—plays an essential role in translation initiation. Recent reports have suggested helicase-dependent and helicase-independent functions for eIF4A, but the multifaceted roles of eIF4A have not been fully explored. Here we show that eIF4A1 enhances translational repression during the inhibition of mechanistic target of rapamycin complex 1 (mTORC1), an essential kinase complex controlling cell proliferation. RNA pulldown followed by sequencing revealed that eIF4A1 preferentially binds to mRNAs containing terminal oligopyrimidine (TOP) motifs, whose translation is rapidly repressed upon mTORC1 inhibition. This selective interaction depends on a La-related RNA-binding protein, LARP1. Ribosome profiling revealed that deletion of EIF4A1 attenuated the translational repression of TOP mRNAs upon mTORC1 inactivation. Moreover, eIF4A1 increases the interaction between TOP mRNAs and LARP1 and, thus, ensures stronger translational repression upon mTORC1 inhibition. Our data show the multimodality of eIF4A1 in modulating protein synthesis through an inhibitory binding partner and provide a unique example of the repressive role of a universal translational activator.

DOI： 10.1038/s41594-024-01321-7

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Language：English   Publishing type：Research paper (scientific journal)   Publisher：Developmental and Comparative Immunology  

The initial defense against invading pathogenic microbes is the activation of innate immunity by binding of pattern recognition receptors (PRRs) to pathogen associated molecular patterns (PAMPs). To explain the action of PRRs from hagfish, one of the extant jawless vertebrates, we purified the GlcNAc recognition complex (GRC) from serum using GlcNAc-agarose. The GRC comprises four proteins of varying molecular masses: 19 kDa, 26 kDa, 27 kDa, and 31 kDa. Exposure of Escherichia coli to the GRC led to the phagocytic activation of macrophages, revealing the opsonic function of the GRC. The GRC in serum formed a large complex with a molecular mass of approximately 1200 kDa. The GRC bound to Escherichia coli but not to rabbit red blood cells, despite both having GlcNAc on their surface. These structural and binding properties are similar to those of mannose-binding lectin (MBL). The amino acid sequence of a portion of the 31 kDa protein in the GRC matched the amino acid sequence of variable lymphocyte receptor (VLR)-B in some place. According to the Western blot analysis, the 31 kDa protein was recognized by the anti-hagfish VLR-B antiserum. Based on the results, it appears that the GRC functions as a PRR like MBL and that its 31 kDa protein has a structure similar to that of VLR-B.

DOI： 10.1016/j.dci.2023.105065

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Language：English   Publisher：Journal of Inflammation Research  

Background: Acute lung injury (ALI) is caused by a variety of illnesses, including aspiration pneumonia and sepsis. The CCR4-NOT complex is a large multimeric protein complex that degrades mRNA through poly(A) tail shortening, whereas it also contributes to regulation of transcription and translation. Cnot3 is a scaffold component of the CCR4-NOT complex and is essential for the integrity of the complex; loss of Cnot3 leads to depletion of whole complex. While the significance of cytokine mRNA degradation in limiting inflammation has been established, the roles of CCR4-NOT complex-mediated in ALI remain elusive. Methods: The effects of Cnot3 haploinsufficiency in the pathology and cytokine expression were analyzed in the mouse lungs of acid aspiration-induced acute lung injury. The decay rate and transcription activity of cytokine mRNAs under Cnot3 heterozygous deletion were analyzed in lipopolysaccharide (LPS)-stimulated mouse embryonic fibroblasts (MEFs). Results: Tamoxifen-induced heterozygous deletion of Cnot3 in adult mice (Cnot3 Hetz) did not show body weight loss or any apparent abnormality. Under acid aspiration-induced acute lung injury, Cnot3 Hetz mice exhibited increased pulmonary edema, worse lung pathologies and more severe inflammation compared with wild type mice. mRNA expression of pro-inflammatory genes Il1b and Nos2 were significantly upregulated in the lungs of Cnot3 Hetz mice. Consistently, mRNA expression of Il1b and Nos2 was upregulated in LPS-stimulated Cnot3 Hetz MEFs. Mechanistically, while heterozygous depletion of Cnot3 stabilized both Il1b and Nos2 mRNAs, the nascent pre-mRNA level of Il1b was upregulated in Cnot3 Hetz MEFs, implicating Cnot3-mediated transcriptional repression of Il1b expression in addition to destabilization of Il1b and Nos2 mRNAs. PU.1 (Spi1) was identified as a causative transcription factor to promote Il1b expression under Cnot3 haploinsufficient conditions. Conclusion: CNOT3 plays a protective role in ALI by suppressing expression of pro-inflammatory genes Il1b and Nos2 through both post-transcriptional and transcriptional mechanisms, including mRNA stability control of Spi1.

DOI： 10.2147/JIR.S468612

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Language：English   Publishing type：Research paper (scientific journal)   Publisher：Genes to Cells  

Tumor-derived G-CSF is a well-known factor to aggravate disease progression in various types of cancers. In this study, we investigated a role of G-CSF in squamous cell carcinoma (SCC). High expression of G-CSF in the tumor tissues of esophageal SCC (ESCC) patients correlated with poor prognosis. Murine SCC NR-S1M cells produce considerable amount of G-CSF, which expression is correlated with its metastatic potentials. Deletion of G-CSF in NR-S1M cells mitigated tumor growth and metastasis to lymph node and lung of subcutaneous NR-S1M tumors in the mice. Mechanistically, G-CSF enhanced cell proliferation in autocrine manner in vitro, whereas in NR-S1M tumor-bearing mice, accumulation of plasma G-CSF was associated with expansion of peripheral neutrophils, which led to a decreased proportion of CD8+ T cells. Antibody depletion of neutrophils restored the number of CD8+ T cells and modestly suppressed tumor outgrowth, albeit no changes in distant metastasis. We propose that G-CSF produced by NR-S1M cells facilitates tumor progression in mice through bi-functional effects to promote neutrophil recruitment and tumor cell proliferation, which may render poor prognosis to the ESCC patients with high G-CSF expression.

DOI： 10.1111/gtc.13051

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Event date： 2023.12

Language：Japanese   Presentation type：Symposium, workshop panel (public)  

Venue：神戸市 神戸国際会議場   Country：Japan  

Angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) is the carboxypeptidase that degrades angiotensin II (Ang II) and improves the pathologies of cardiovascular disease and acute respiratory distress syndrome (ARDS)/acute lung injury. B38-CAP, a carboxypeptidase derived from Paenibacillus sp. B38, is an ACE2-like enzyme to decrease angiotensin II levels in mice and ameliorates hypertension and heart failure (Nat Commun. 2020). Here we show the therapeutic effects of B38-CAP on acute lung injury induced by abdominal sepsis, acid aspiration, or SARS_CoV2 infection. ACE2 expression was downregulated in the lungs of hamsters with SARS-CoV2 infection, or the lungs of mice with cecal ligation puncture (CLP)-induced sepsis or acid-induced lung injury thereby leading to upregulation of Ang II levels. Intraperitoneal injection of B38-CAP decreased Ang II levels and suppressed the pathologies of lung inflammation, improved lung dysfunction, and downregulated elevated cytokine mRNA levels in acute lung injury in these animal models. Thus, systemic treatment with an ACE2-like enzyme might be a potential therapeutic strategy for patients with severe sepsis or ARDS (Nat Commun. 2021; PLoS One. 2022).

Event date： 2023.12

Language：Japanese   Presentation type：Symposium, workshop panel (public)  

Venue：神戸市 神戸国際会議場   Country：Japan  

Heart failure is a leading cause of death in developed countries. The role of mRNA regulation in the pathology of heart failure remains elusive. CCR4-NOT complex is a multi-subunit protein complex constituting exonuclease-mediated degradation of mRNA’s poly(A) tails, a process called deadenylation. Here we analyzed the roles of deadenylase subunit in heart failure. After 2 weeks of transverse aortic constriction (TAC)-induced pressure overload, expression of CNOT6L deadenylase subunit was markedly upregulated in the hearts. Loss of CNOT6L significantly decreased cardiac contractility and enhanced fibrosis at 2 weeks after TAC. Transcriptome analyses elucidated that CNOT6L targets mRNA of the GeneX, which stimulates tissue fibrosis. Furthermore, CNOT6L markedly suppressed geneX expression in cardiac fibroblasts. Poly(A) tail length and luciferase reporter analyses revealed that CNOT6L regulates deadenylation via the cis-element in the geneX 3'UTR. Double knockout of GeneX and CNOT6L improved cardiac fibrosis and dysfunction in single CNOT6 knockout mice. Thus, CNOT6L deadenylase prevents the progression of heart failure by suppressing the expression of fibrotic geneX in cardiac fibroblasts, implicating a potential therapeutic strategy of targeting mRNA deadenylation.

Event date： 2023.10 - 2024.11

Language：Japanese   Presentation type：Oral presentation (general)  

Venue：福岡市　福岡国際会議場   Country：Japan  

CCR4-NOT複合体は酵母からヒトに至るまで高度に保存されたタンパク質複合体であり、mRNAのpoly(A)鎖分解(脱アデニル化)を介したRNA分解の実行因子である。脱アデニル化はRNA分解過程の第一段階である一方で、同時に分解産物としてのAMPを産生することが知られてた。しかし、その代謝経路や細胞内における生理作用は不明であった。そこで、本研究では、脱アデニル化により生成されるAMPが細胞の生理機能にどのような役割を果たすのかを解析した。まず、poly(A)鎖を32Pラベルした人工合成mRNAを細胞内に導入すると、mRNA由来のAMP, ADP, 及びATPが産生されることがわかり、複合体中心タンパク質であるCNOT1の遺伝子欠損細胞ではこれらの産生が低下することがわかった。また、CNOT1を欠損した心臓ではAMP及びATP量の有意な減少を認めたことから、CCR4-NOT複合体の脱アデニル化代謝はAMP産生を介して細胞内ATPの維持に寄与することが示唆された。一方で、CNOT1の遺伝子欠損は重篤な細胞死を誘発してしまうことから、CNOT1ヘテロ遺伝子欠損細胞を用いてさらに詳細を解析した。CNOT1ヘテロ遺伝子欠損細胞の増殖能や生存は野生型細胞と変わらないものの、2-Deoxy-D-glucose (10uM)とAntimycin (36uM)の添加によりミトコンドリア呼吸鎖並びに解糖系抑制下のATP量を測定した結果、野生型細胞よりも早いATP量の減少を認めた。この理由として、脱アデニル化の低下に連動するATP産生の減少がこの一因ではないかと考え現在解析を進めている。一方で、ミトコンドリア呼吸鎖並びに解糖系についても細胞外フラックスアナライザーで解析した結果、CNOT1ヘテロ欠損細胞ではミトコンドリアにおけるATP産生能も減少していることがわかった。心臓におけるCCR4-NOT複合体の機能不全はAMPによって活性化されるAMPK活性の低下を生じることを見出しており、AMPKが制御するミトコンドリア生合成の低下がこの原因ではないかと考えられる。以上の結果から、CCR4-NOT複合体による脱アデニル化は単に不要なmRNAの分解作用のみならず、AMPの産生を介した多面的な作用により細胞内ATPの恒常的維持に重要な役割を果たしていることが明らかとなった。

Event date： 2023.10

Language：Japanese   Presentation type：Oral presentation (general)  

Venue：岡崎市 生理学研究所   Country：Japan  

CCR4-NOT複合体は酵母からヒトに至るまで高度に保存されたタンパク質複合体であり、mRNAのpoly(A)鎖分解(脱アデニル化)を介したRNA分解の実行因子である。脱アデニル化は分解産物としてのAMPを産生することが知られていたが、その代謝経路や細胞内における生理作用は不明であった。そこで、本研究では、脱アデニル化により生成されるAMPが細胞の生理機能にどのような役割を果たすのかを解析した。poly(A)鎖を32Pラベルした人工合成mRNAを細胞内に導入すると、mRNA由来のAMP, ADP, 及びATPが産生されることがわかり、複合体中心タンパク質であるCNOT1の遺伝子欠損細胞ではこれらの産生が低下することがわかった。また、CNOT1を欠損した心臓ではAMP及びATP量の有意な減少を認めたことから、CCR4-NOT複合体の脱アデニル化代謝はAMP産生を介して細胞内ATPの維持に寄与することが示唆された。心臓におけるCCR4-NOT複合体の機能不全はAMPによって活性化されるAMPK活性の低下を生じることを見出しており、以上の結果から、CCR4-NOT複合体による脱アデニル化は単に不要なmRNAの分解作用のみならず、AMPの産生を介した多面的な作用に重要な役割を果たしていることが明らかとなった。

Event date： 2023.9

Language：Japanese   Presentation type：Oral presentation (general)  

Venue：秋田市 カレッジプラザ   Country：Japan  

CCR4-NOT複合体は酵母からヒトに至るまで高度に保存されたタンパク質複合体であり、mRNAのpoly(A)鎖分解(脱アデニル化)を介したRNA分解の実行因子である。脱アデニル化はRNA分解過程の第一段階である一方で、同時に分解産物としてのAMPを産生することが知られてた。しかし、その代謝経路や細胞内における生理作用は不明であった。そこで、本研究では、脱アデニル化により生成されるAMPが細胞の生理機能にどのような役割を果たすのかを解析した。まず、poly(A)鎖を32Pラベルした人工合成mRNAを細胞内に導入すると、mRNA由来のAMP, ADP, 及びATPが産生されることがわかり、複合体中心タンパク質であるCNOT1の遺伝子欠損細胞ではこれらの産生が低下することがわかった。また、CNOT1を欠損した心臓ではAMP及びATP量の有意な減少を認めたことから、CCR4-NOT複合体の脱アデニル化代謝はAMP産生を介して細胞内ATPの維持に寄与することが示唆された。一方で、CNOT1の遺伝子欠損は重篤な細胞死を誘発してしまうことから、CNOT1ヘテロ遺伝子欠損細胞を用いてさらに詳細を解析した。CNOT1ヘテロ遺伝子欠損細胞の増殖能や生存は野生型細胞と変わらないものの、2-Deoxy-D-glucose (10uM)とAntimycin (36uM)の添加によりミトコンドリア呼吸鎖並びに解糖系抑制下のATP量を測定した結果、野生型細胞よりも早いATP量の減少を認めた。この理由として、脱アデニル化の低下に連動するATP産生の減少がこの一因ではないかと考え現在解析を進めている。一方で、ミトコンドリア呼吸鎖並びに解糖系についても細胞外フラックスアナライザーで解析した結果、CNOT1ヘテロ欠損細胞ではミトコンドリアにおけるATP産生能も減少していることがわかった。心臓におけるCCR4-NOT複合体の機能不全はAMPによって活性化されるAMPK活性の低下を生じることを見出しており、AMPKが制御するミトコンドリア生合成の低下がこの原因ではないかと考えられる。以上の結果から、CCR4-NOT複合体による脱アデニル化は単に不要なmRNAの分解作用のみならず、AMPの産生を介した多面的な作用により細胞内ATPの恒常的維持に重要な役割を果たしていることが明らかとなった。

Type：Competition, symposium, etc. 

Type：Competition, symposium, etc.