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山上 健、沖啓輔、高島夏希、高藤三加、真柳浩太、石野園子、石野良純, Thermococcus kodakarensis由来ファミリーD DNAポリメラーゼの調整法の改良とその生化学的解析, 日本分子生物学会, 2019.12, ファミリーD DNAポリメラーゼ (PolD) は、アーキア特有の酵素であり、クレンアーキオタ以外のサブドメインでホモログ遺伝子が見つかっている。アーキア細胞内では、PolDは、ファミリーB DNAポリメラーゼ (PolB) と共に必須の複製酵素であると予想されてきたが、近年、一部のユリアーキオタにおいて、polB破壊株が得られたという報告が相次いだことから、アーキアの複製酵素としての可能性がより高まった。我々は、超好熱性アーキアThermococcus kodakarensisのPolDについて、その構造と機能を詳細に理解するために研究を進めている。PolDおよびその構成タンパク質であるDP1、DP2について、精製法の検討を行ってきた。すでに報告している方法 (Extremophiles, 23, 161 (2019))をさらに改良し、基材との弱い相互作用を期待し、親水性ビニルポリマーを基材としたTOYOPEARL Phenyl-650S（疎水性）、ヘパリン（親和性）および親水性ポリマーを基材としたYMC BioPro SmartSep Q（陰イオン交換）カラムを用いて高純度にタンパク質の精製を行った。その結果、疎水クロマトでは、DP1-DP2複合体がきれいなピークとして溶出し、陰イオン交換クロマト後のサンプルで、より高純度に精製されていることがSDS-PAGEで確認された。次に、DP2の各ドメインタンパク質を同様に精製し、DP1との結合およびDNAとの結合を調べた結果、DP1とDP2-C-terminal domain (-CTD)が結合し、その複合体はprimed-DNAに結合することがわかった。現在、複合体の結晶化を試みるとともに、電子顕微鏡単粒子解析によって、PolDの全体構造およびPolDがDNA上で作用する際の構造モデル構築を目指している。. |
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山上 健、瀬戸口勇登、沖 啓輔、石野園子、石野良純, クレンアーキオータクレンアーキオータ門において機能的にヘリカーゼとプライマーゼプライマーゼを連結するタンパク質の検索, 日本分子生物学会, 2018.12. |
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山上 健, 温泉土壌メタゲノム情報を利用した新規DNAポリメラーゼの創製, 日本分子生物学会, 2008.12. |
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山上 健、興梠聖哉、田島秀二、河原林裕、石野良純, 温泉土壌メタゲノム情報を利用したTaqポリメラーゼの創製, 日本分子生物学会, 2007.12. |
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山上 健、興梠聖哉、田島秀二、河原林 裕、石野良純, 温泉土壌メタゲノム情報を利用したTaqポリメラーゼの創製, 日本分子生物学会, 2007.12. |
| 6. |
當利和夫、藤兼亮輔、山上 健、品川日出夫、石野良純, 超好熱性古細菌Pyrococcus furiosus由来family D DNA polymeraseの機能及び構造解析, 日本分子生物学会年会, 2003.12. |
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高山耕平、藤兼亮輔、山上 健、麻生陽一、石野良純, 超好熱性アーキアPyrococcus furiosus由来DNAリガーゼの性質解析, 日本農芸化学会関西、西日本、中四国支部合同大会, 2003.09. |
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山上 健、吉永亜耶、石野良純, 大腸菌および酵母Two-hybridシステムを用いた古細菌DNA複製開始複合体と相互作用するタンパク質因子の検索, 日本分子生物学会年会, 2003.12. |
| 9. |
吉永亜耶、山上 健、麻生陽一、石野良純, 新規DNA複製関連因子の探索, 日本農芸化学会西日本支部大会, 2003.09. |
| 10. |
服部辰彦、山上 健、麻生陽一、石野良純, DNA複製因子PCNA-RFC間の機能的相互作用解析, 日本農芸化学会関西、西日本、中四国支部合同大会, 2003.09. |
| 11. |
服部辰彦、山上 健、麻生陽一、石野園子、大山拓次、森川耿右、石野良純, DNA複製因子PCNA-RFC間の機能的相互作用解析, 日本分子生物学会年会, 2003.12. |
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平良 東紀,大沼 貴之,山上 健,麻生 陽一,石原 昌信,石黒 正恒, ライ麦種子クラスIキチナーゼの真菌細胞壁への結合と抗真菌活性, 日本農芸化学会大会, 2002.03. |
| 13. |
大沼貴之，八木美佳子，山上 健，麻生陽一，石黒正恒, ライ麦種子キチナーゼ遺伝子のクローニングと大腸菌による発現, 日本農芸化学会大会, 2001.03. |
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平良東記、大沼貴之、山上 健、麻生陽一、石原昌信、石黒正恒, ライ麦種子キチナーゼの抗カビ活性, 日本農芸化学会関西、西日本、中四国合同大会, 2001.10. |
| 15. |
鈴川啓輔，大沼貴之，山上 健，麻生陽一，石黒正恒, チューリップ球根キチナーゼの部位特異的変異, 日本農芸化学会大会, 2001.03. |
| 16. |
大沼貴之、山上 健、麻生陽一、石黒正恒, ライ麦キチナーゼ遺伝子のクローニング, 日本農芸化学会西日本支部大会, 2000.09. |
| 17. |
鈴川啓輔，山上 健，堤 一貴，石黒正恒, チューリップ球根キチナーゼ遺伝子のクローニング，発現および変異, 日本農芸化学会大会, 2000.04. |
| 18. |
鈴川啓輔、大沼貴之、山上 健、石黒正恒, チューリップ球根キチナーゼの部位特異的変異, 日本農芸化学会西日本支部大会, 2000.09. |
| 19. |
平良東紀，山上 健，麻生陽一，石黒正恒, ライ麦種子キチナーゼの局在性と種子登熟過程における変動, 日本農芸化学会大会, 1999.03. |
| 20. |
平良東紀, 山上 健, 麻生陽一, 石黒正恒, 植物クラスIキチナーゼに関する研究（その1）:Cys-richドメインに対する抗体の性質, 日本農芸化学会大会, 1998.04. |
| 21. |
堤 一貴, 山上 健, 麻生陽一, 石黒正恒, チューリップ球根キチナーゼ(TBC-1)のトリプトファン残基の化学修飾, 日本農芸化学会大会, 1998.04. |
| 22. |
山上 健, 石黒正恒, チューリップ (Tulipa tarda) 球根キチナーゼ(TBC-2)の全アミノ酸配列, 日本農芸化学会大会, 1998.04. |
