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米根鉄矢、清宮正徳、外園栄作、＠大澤進, マルトースの高感度測定法の開発, 第34回生物試料分析科学会年次学術集会, 2024.03. |
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濱野 佑、外園栄作, MALDI-TOF/MSを用いた尿中Tamm-horsfall-Protein(THP)の糖鎖分析〜分析前試料の条件検討〜, 第34回生物試料分析科学会年次学術集会, 2024.03. |
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大澤 進、大藤 有未、外園栄作, 老化バイオマーカーとしての血中NAD+・NADH測定法の構築に関する検討-実試料測定に向けたNADH測定法の改良-, 第34回生物試料分析科学会年次学術集会, 2024.03. |
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余門 明里 、佐谷 純一 、緒方 昌倫 、古賀 秀信 、勝田 仁 、外園 栄作, 人間ドック受診者を対象とした機械学習を用いた腎機能評価予測アルゴリズムの開発, 第34回生物試料分析科学会年次学術集会, 2024.03, 【目的】
近年、医療分野において人工知能（AI）を活用した研究が活発に行われ、画像診断や癌などの分野では機械学習を用いた予測モデルの作成が数多く行われている。しかし、腎機能評価の予測に関する研究はまだ少ない。本研究では機械学習の手法を用いて、人間ドック受診者の検査データから将来の腎機能を予測するアルゴリズムの開発を行う。早期に腎機能の低下を予測することによって、腎不全の発症および重症化して透析導入に至るリスクの高い対象者を、より早い段階で特定することができると考えられる。
【方法】
この研究では、2015年1月1日から2022年3月31日までの期間に、九州中央病院の人間ドックを受診した方の検査情報を収集した。総データ数は17,738件、総受診者数は7,181名で、男性3,329名、女性3,852名、初回平均年齢は46.09歳であった。収集した検査情報は、年齢・性別・身長・体重・腹囲・血圧、血液検査データ（31項目）・尿定性検査・超音波検査所見（上腹部）・心電図所見・既往歴・薬物治療歴・喫煙・飲酒有無であった。人間ドックを2回以上受診している健常者を対象に、糸球体濾過量（eGFR値）の低下率によって腎機能安定群と悪化群を分類した。そして、初回の検査情報から腎機能安定群と悪化群を予測するアルゴリズムの作成を行った。
【結果】
ランダムフォレストを用いたモデルで５分割交差検証を行った結果、平均正解率0.83のモデルを構築した。また、ロジスティック回帰やサポートベクターマシンなど複数の手法においても、同程度の精度のモデルを作成した。現在、特徴量の絞り込みやパラメータの調整など更なる検討を行い、より高精度なモデルを開発中である。
【結論】
本研究では、人間ドック受診者のデータを利用して、健常者の腎機能評価を予測するための機械学習アルゴリズムを開発した。今後、より高い精度を目指してモデルを改良することで、将来の腎不全や透析導入のリスク予測に貢献することが期待される。. |
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深川結妃 、外園 栄作、大澤 進, アルコール摂取量のバイオマーカーとしてのホスファチジルエタノールの酵素的測定法に関する検討, 第34回生物試料分析科学会年次学術集会, 2024.03. |
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深川結妃 、表田麻衣 、外園 栄作、大澤 進, 飲酒のバイオマーカーとしてのホスファチジルエタノール（PEth)測定法の開発〜臨床検体分析に向けたPEthの保存条件に関する検討〜, 第34回生物試料分析科学会年次学術集会, 2024.03. |
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余門 明里 、佐谷 純一 、緒方 昌倫 、古賀 秀信 、勝田 仁 、外園 栄作, 人間ドック受診者を対象とした機械学習を用いた腎機能評価予測アルゴリズムの開発, 第32回福岡県医学検査学会, 2023.09, 【目的】
近年、医療分野において人工知能（AI）を活用した研究が活発に行われ、画像診断や癌などの分野では機械学習を用いた予測モデルの作成が数多く行われている。しかし、腎機能評価の予測に関する研究はまだ少ない。本研究では機械学習の手法を用いて、人間ドック受診者の検査データから将来の腎機能を予測するアルゴリズムの開発を行う。早期に腎機能の低下を予測することによって、腎不全の発症および重症化して透析導入に至るリスクの高い対象者を、より早い段階で特定することができると考えられる。
【方法】
この研究では、2015年1月1日から2022年3月31日までの期間に、九州中央病院の人間ドックを受診した方の検査情報を収集した。総データ数は17,738件、総受診者数は7,181名で、男性3,329名、女性3,852名、初回平均年齢は46.09歳であった。収集した検査情報は、年齢・性別・身長・体重・腹囲・血圧、血液検査データ（31項目）・尿定性検査・超音波検査所見（上腹部）・心電図所見・既往歴・薬物治療歴・喫煙・飲酒有無であった。人間ドックを2回以上受診している健常者を対象に、糸球体濾過量（eGFR値）の低下率によって腎機能安定群と悪化群を分類した。そして、初回の検査情報から腎機能安定群と悪化群を予測するアルゴリズムの作成を行った。
【結果】
ランダムフォレストを用いたモデルで５分割交差検証を行った結果、平均正解率0.83のモデルを構築した。また、ロジスティック回帰やサポートベクターマシンなど複数の手法においても、同程度の精度のモデルを作成した。現在、特徴量の絞り込みやパラメータの調整など更なる検討を行い、より高精度なモデルを開発中である。
【結論】
本研究では、人間ドック受診者のデータを利用して、健常者の腎機能評価を予測するための機械学習アルゴリズムを開発した。今後、より高い精度を目指してモデルを改良することで、将来の腎不全や透析導入のリスク予測に貢献することが期待される。. |
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廣田みなみ，大澤 進，外園栄作, Nitro-PAPSを用いた尿中鉄の測定法の開発, 生物試料分析科学会, 2023.03, 【背景・目的】
ヒトにおいて必須の微量元素である鉄は，造血や生体のエネルギー代謝において重要な役目を担うとされる．鉄の生体動態は，血液疾患，肝疾患，悪性腫瘍，炎症性疾患などさまざまな疾患や病態において変化するとされ，その動きを見る指標として血清鉄などの検査が行われている．一方，尿中鉄は糖尿病性腎症や慢性腎臓病など腎疾患において変化すると報告されているが，血清鉄と比較して尿中鉄に関する報告は少なく，日常検査としてはあまり測られていないのが現状である．また，血清鉄の測定には主にNitroso-PSAPによるキレート比色法が用いられているが，尿中の鉄を対象とした液状試薬は無い．尿中鉄は血清鉄に比べて微量であり，現状の血清鉄用の測定試薬で尿中鉄を測定するには感度が不十分である．これまでの尿中への鉄排泄量に関する報告においては原子吸光分析や質量分析を用いたものがほとんどで，日常検査として利用するには煩雑である．尿中鉄を簡便に測定できれば，尿中鉄の排泄動態研究をさらに加速させる一助となるのではないかと考える．そこで，本研究ではNitroso-PSAPより鉄へのモル吸光係数が大きいとされる金属キレーターNitro-PAPSを用いて，尿中鉄の高感度測定法の開発について検討を行ったので報告する．
【方法】
各種pHの異なる緩衝液に金属キレート試薬と各種金属（Fe2+，Fe3+，銅，亜鉛，ニッケル，コバルト）水溶液を添加し，鉄を測定するのに適した条件を検討した．また，チオグリコール酸やホモシステインを用いて，鉄以外の金属の隠蔽方法についても検討した．検討後の条件を用いて基礎的性能評価を行った．
【結果】
1)MES(2-Morpholinoethanesulfonic acid, monohydrate)溶液をNaOHでpHを調整し検討に用いた結果，至適pHは4.2であり,更に 4級アンモニウムイオンHexadecyltrimethylammonium Bromideの添加により三次元錯体が形成されたと考えられ，吸収曲線の長波長側へのシフト（580 nmから590 nm）を確認した．
2)チオグリコール酸（25 mmol/L）とホモシステイン（7 mmol/L）を用いることで，600 nm付近における銅と亜鉛の吸収を抑制することができたが，ニッケル，コバルトへの反応性は30〜60%の抑制効果に留まった．
3)基礎的性能評価：直線性の検討では，10 µmol/Lまでの直線性を確認した．併行精度の検討では，5 µmol/L Fe2+水溶液を用いた変動係数は2.23%（n=16）であった．室内精度（n=16）の検討では日間変動0.33%, 日内変動2.21%であった．検出感度は0.504 µmol/L, 定量限界はCV 10%点で2.015 µmol/Lであった．
【結論】
今回の検討で金属キレーターNitro-PAPSを用いて，鉄に特異的な反応条件を設定し，尿中鉄の高感度測定法への応用の可能性を見出すに至った．しかし，報告されている尿中鉄濃度と比較すると感度がまだ不足しており，本法を尿中鉄の測定に応用するには感度の改善と実試料を用いた更なる検討が必要である．
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深川結妃,大澤 進、外園栄作, 抗原抗体反応と酵素法を用いたホモジニアスによる高感度検出技術に関する検討, 生物試料分析科学会, 2023.03, 【はじめに】エンザイムイムノアッセイは高感度だが微量の発光や蛍光を測定するため,B/F分離操作や特殊で高額な検出装置が必要なうえ,煩雑な手順と反応に長時間を要する.このような状況において, B/F分離操作が不要で,自動分析装置による可視部検出による高感度なホモジニアスエンザイムイムノアッセイの開発は進んでいない.そこで,酵素的測定法と免疫学的測定法の両者の利点を組み合わせた新たな検出技術の開発を試みる.つまり,可視部検出の生化学自動分析装置を用いた短時間測定というB/F分離不要な抗原抗体反応と酵素的検出法の組合せによる高感度な測定のための基礎実験を行う. 本構想では, ホモジニアスエンザイムイムノアッセイから直接的に発色検出することで高感度化を実現し,微量成分への適用を理想とする.なお,最終的には自動分析装置を用いた分光分析への適用を想定しているため,長時間安定な試薬成分を用い, ホモジニアスエンザイムイムノアッセイを目指す.
【原理】 抗体を蛋白分解酵素(ペプシン・パパイン)および還元剤を用いてFab部分のH鎖とL鎖に分解し,断片化したH鎖とL鎖それぞれに標識酵素とその基質を修飾する.両者が測定対象成分を介して近距離で高い酵素反応が誘発され,そこで生じる呈色を測光するという原理を構想している.
【方法】 蛋白分解酵素や還元剤によってアルブミン抗体が断片化されたのを確認するためにポリアクリアミドゲル電気泳動(PAGE)を用いて,断片化したアルブミン抗体の分子量推定を行なった．また，処理後の抗体断片が抗原認識性を有するかを検証するためにウエスタンブロッティングを行なった．転写後のフッ化ポリビニリデン (PVDF)膜をアルブミン溶液に浸し，洗浄後にHorseradish Peroxidase (HRP)標識抗ヒトアルブミン抗体を反応させた．反応後のPVDF膜を水洗した後に3,3'Diaminobenzidine (DAB)を用いて検出を行った.
【結果】PAGEの結果，蛋白分解酵素および還元剤の処理を施した検体レーンのバンドは未処理のそれと比較して，より低分子側でバンドを検出した．また，転写後のPVDF膜上のDAB発色像では,すべてのレーンの高分子側でブロード状の発色像を示した．また，ペプシン処理を施したレーンにおいて70～120 kDaおよび20 kDa付近において明瞭なバンドを確認した.
【考察】分子量マーカーの位置より,低分子領域で確認されたバンドは，アルブミン抗体が特定部位で切断されたF(ab’)2，Fab断片であることが推測された．また, PVDF膜上の低分子領域のバンドは, 理論上ペプシン処理により得られるF(ab’)2断片と考えられ，アルブミンと反応し標識抗体が発色していることから， F(ab’)2断片においてアルブミンの抗原認識性を有していることが示された.また20 kDa付近においてもバンドが見られたことは，さらに細かく断片化した抗体でも、なお同様に抗原認識性を有して可能性があるといえる.
【結語】今回の抗体処理法を応用して抗原認識性を有した状態で,標識酵素とその基質を結合させたフラグメント（Fab）を作成し,ホモジニアスエンザイムイムノアッセイの基礎検討を行う.
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福元沙織、大澤 進、外園栄作, LAMP法およびPCR法における核酸増幅後試料中に含まれるピロリン酸の高感度検出技術の開発, 生物試料分析科学会, 2023.03, 【はじめに】
遺伝子検査における核酸増幅技術は、細菌やウイルスの感染の検査や、がんの診断を行う目的で用いられ、臨床検査において今後更にその用途は拡大すると予想される。現在までに既に各社から核酸増幅法が考案されているが、その増幅検出技術においては、核酸増幅時の副産物ピロリン酸を蛍光プローブ等にて検出する方法が主流となっている。しかし、この検出法では励起装置や蛍光検出器など特殊な装置や高価な蛍光試薬が必要となる。遺伝子検査において、特に細菌やウイルス感染の有無を検査する際には、短時間で検査結果を得ることができる迅速性と、緊急時においても測定ができる簡便性が重要である。そこで本研究では、核酸増幅過程で生成されるピロリン酸を、酵素を用いて可視領域において高感度に検出することで、汎用生化学自動分析装置により簡便で10分と迅速な核酸増幅量の検出技術の開発を試みた。さらに、本法を用いてLAMP法およびPCR法における核酸増幅後試料を測定した。
【方法】
本法では、ピロリン酸にヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（HPT）およびキサンチンオキシダーゼ（XOD）を作用させて生成した過酸化水素（H2O2）を利用する。過酸化水素の作用によって二価鉄を三価鉄に変換した後、金属キレーター5-Br-PAPSを添加し、形成された三価鉄・5-Br-PAPSの錯体の発色を600 nmにて呈色・検出する。
分析機器：日立7170形自動分析装置。試薬：第一試薬（R1）：pH 8.0、50 mmol/L Tris-HCl、0.4 kU/L HPT、2.5 kU/L XOD、1.0 mmol/L塩化マグネシウム、0.25 mmol/Lイノシン-5'-リン酸含有。第二試薬（R2）：pH 3.0、1.0 mol/Lギ酸緩衝液、200 µmol/L硫酸鉄、100 µmol/L 5-Br-PAPS含有（濃度は反応液終濃度）。試料：ピロリン酸ナトリウム水溶液。分析法：各検体量は試料/R1/R2：5/110/60 µL。測定波長（主/副）は 600/800 nm、2 point-end assay。反応温度は37℃、測定時間は10分。
これら条件のもと直線性、併行精度などの基礎的性能評価を行い、LAMP法およびPCR法における核酸増幅後試料中のピロリン酸を測定した。
【結果】
本法のモル吸光係数は、通常の過酸化水素検出系と比較して約10倍高感度でピロリン酸を検出できた。直線性は0〜1.0 µmol/Lまで認められ、併行精度試験では、低・中・高濃度のいずれの濃度においても変動係数（C.V.）1.25 %以下であり、良好な再現性が確認できた（n=20）。また、LAMP法およびPCR法での核酸増幅後試料の測定においてもピロリン酸を検出することが可能であった。さらに、いずれの核酸増幅法においても陰性試料と陽性試料のピロリン酸濃度に有意な差があることを確認した。
【考察】
核酸増幅過程の副産物であるピロリン酸を、XODを用いた酵素的測定法における検出を試み、二価鉄と5-Br-PAPSの錯体呈色反応を利用することで、可視領域において高感度に検出できた。また、LAMP法およびPCR法における核酸増幅後試料を測定した結果、ピロリン酸の測定が可能であり、さらに陰性試料および陽性試料のピロリン酸濃度に有意差がみられた。このことから汎用生化学自動分析装置により核酸増幅の有無を簡便に可視化と定量化できる可能性が見出された。今後は、本測定技術の臨床検査への応用の可能性を検証し、核酸増幅量の検出技術の確立を目指す。. |
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岡本拓磨, 大澤 進，外園栄作
, 抱合型ビリルビン特異的化学的酸化法開発に関する検討, 生物試料分析科学会, 2023.03, 【はじめに】
血清ビリルビン分画測定法はジアゾ法によって直接ビリルビンと間接ビリルビンの分画測定法を基準として酵素法や化学的酸化法が開発され、日常検査に利用されてきた。その後、HPLC法によりアルブミン結合ビリルビン（δ-ビリルビン）が報告され、特異的な抱合ビリルビン酵素的測定法が市販化された。
ビリルビン分画の測定法のうち直接ビリルビンを測定する方法としては安価であるバナジン酸を用いた化学的酸化法が多くの施設で利用されている。しかし、この化学的酸化法の直接ビリルビン値には抱合型ビリルビンに加え、δ-ビリルビンを測り込む問題がある。このことは臨床において、血中アルブミンと共有結合したδ-ビリルビンが長期的に血中に残存し、閉塞性黄疸の減黄期において、抱合型ビリルビン(C-Bil)が低下しているにも関わらず、直接ビリルビン値が依然として高値を示すことから、臨床所見とデータとの乖離の原因となっていた。そこで、本検討ではδ-ビリルビンを測り込まない抱合型ビリルビン特異的化学的酸化法の開発を目指し、若干の知見を得たので報告する。
【方法】
本検討では、日立7600形自動分析装置を用いて、試料20 µL、δ-ビリルビンへの反応低減物質Aを含む第一試薬 130 µLと約2.5分反応させた後に270 µL酒石酸緩衝液を第二試薬、70 µLバナジン酸含有溶液を第三試薬として、測定波長(主/副): 450/546 nm、2 point-rate assayにて分析し、基礎的性能評価を行った。分析の際の校正用の標準物質としてBilirubin conjugate(Bilirubin Ditaurine Amide, Disodium Salt)をFrontier Science(株)より購入し, 11 mg/dLに調製したものを用いた。
【結果】
本法における併行精度(n=10)・室内精度(n=15)は低・中・高濃度においていずれもCV 5.2%以下と良好な結果となった。直線性は0〜26.3 mg/dLまで確認でき、δ-ビリルビンを含まない試料での本法と現行バナジン酸酸化法(n=20)および高速液体クロマトグラフィ(High Performance Liquid Chromatography: HPLC) (n=10)との相関はそれぞれr=0.998、0.995といずれも良好な結果であった。また、Bland-Altman分析において本法と各種方法間で比例系統誤差が認められた。血清にジタウロビリルビンを添加した試料を用いた添加回収率は103 %と良好な結果となった。アスコルビン酸の影響は20 mg/dLまで回避することができた。また、δ-ビリルビンへの反応性は現行のバナジン酸酸化法と比べ約74 %抑えることが可能であった。
【考察】
本法では現行法と比べてδ-ビリルビンへの反応低減物質Aを反応させることで、δ-ビリルビンへの反応を大きく抑制することが可能となった。抱合型ビリルビンに対してより特異性が向上した測定法となったと考えている。今後、更なる特異性の向上とさまざまな臨床検体を用いて、実試料に対する基礎的性能評価や測定原理の異なる他法との比較を検討したいと考えている。
【結語】
抱合ビリルビンへの特異性が優れた化学的酸化法の測定試薬に更なる改良を加え、信頼性の高いビリルビン分画測定値が得られる方法への検討を継続したい。. |
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深川結妃, 大澤 進，外園栄作, 特異的抱合型ビリルビン測定法の開発 ―δビリルビンの基準物質作製に関する検討―
, 生物試料分析科学会, 2023.03, 【はじめに】
血清中のビリルビンは，主に赤血球の破壊によって溶出するヘモグロビンの構成要素であるヘムに由来している．このヘムは，脾臓，肝臓，骨髄などの網内系細胞において,ヘムオキシゲナーゼによりFe2+の解離，ポルフィリン環の開環代謝を受けビリベルジンとなる.このときビリベルジンはビリベルジン還元酵素により還元・生成されたものがビリルビンである．そのため血清ビリルビンの濃度は，肝胆道系疾患および体内溶血の亢進時に血液中で増加し,これらの黄疸鑑別診断や病態の進行状況を把握するうえで重要な検査項目である．血清中のビリルビンが長期間滞留するとアルブミンと共有結合しδビリルビンが生じる。血液中滞留時間はアルブミンと同じであるため、黄疸回復期では病態を反映せず、かなり長期期間滞留することで、臨床上の判断に影響を与えることが知られている。
そのような中，現在の化学的酸化法を原理とするビリルビン測定法では,抱合型ビリルビン測定時にδビリルビンの測り込みが生じており，正確な抱合型ビリルビンのみの測定ができていないという問題がある．そこで本研究では，δビリルビンを抱合型ビリルビンとして測り込むことのない，抱合型ビリルビンに特異的な化学的酸化法の開発を目指し，今回はその前段階として基準物質として使用するためのδビリルビンの抽出・精製法および、その保存安定性について検討を行った．
【方法】
δビリルビンの抽出・精製はKuenzleらと渭原の方法に従った．要約すると 市販のビリルビンと Woodward試薬Kを有機溶媒に溶解させSephadex G-25(fine)にて溶出後の3層目の濃い黄色〜オレンジ層を分取し、凍結乾燥させ粉末状のBWビリルビンを得た．このBWビリルビンとヒト血清アルブミンをPBSに混合・溶解し20℃暗所にて約10時間攪拌の後にδビリルビンを得た.δビリルビンの精製純度および安定性の確認は, 大澤らの高速液体クロマトグラフィによる方法を用いた．また，精製したδビリルビンの純度を高めるために限外濾過フィルタ（VIVASPIN 2:分画分子量10万:Sartorius社製）を用いて遠心機にて4000G, 30分間の遠心にてγグロブリンの除去を行った．また，この精製過程で得られるBWビリルビンとδビリルビンの保存安定性についての3条件（-80℃, -20℃, 室温（約20℃）：7日間）において比較検討を行った．
【結果】
精製したδビリルビンはHPLC法で6〜12分に溶出された(溶出ピーク時間:8.2分)また，蛋白吸収を示す280 nmにおける検出において，δビリルビンが溶出される時間とほぼ同時刻にγグロブリンが溶出されていることがわかったが，限外濾過フィルタ処理後のクロマトグラムではγグロブリンによるピークの消失を確認することができた．また，保存安定性試験においてBWビリルビンは-80℃, -20℃の保存で約30%低下したが，δビリルビンはいずれの条件下でも10%以内の減少に留まった．
【考察】
δビリルビンの精製時のγグロブリンの混入は使用したアルブミン試薬に混在していたものと推測した．保存安定性の悪いBW ビリルビンに対し,今回精製したδビリルビンは安定していると考えられる.このことは，δビリルビンが，アルブミン代謝に依存して血中での消失時間が長く，長期に滞在することを意味し，δビリルビンを測り込む試薬においては臨床判断に影響を与える可能性を示唆するものと言える.
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濱野 佑、林 麟太郎、外園栄作, 尿中Tamm-horsfall-Protein(THP)測定法に関する検討-尿中細菌の影響回避の試み-
, 生物試料分析科学会, 2023.03, 【はじめに】
Tamm-horsfall-Protein(THP)は健常者尿中に最も多く排泄される糖蛋白質で単分子量が約 85-100 kDa、尿沈渣成分として観察される円柱の基質成分として知られている。健常人の尿中蛋白成分の約50％を占めており、成人では1日あたり50 - 100 mg が排泄されると考えられている。このTHPの1日排泄量は、糸球体濾過量に反映され、クレアチニンクリアランス(Ccr)、尿浸透圧との相関が見られ、残存ネフロン数や尿細管機能に依存すると考えられている。また、分子量の約 30％を糖鎖が占めており、この糖鎖の部分が THP の臨床的有用性の鍵を握っているのではないかとも考えられている。従来から、尿中THPの分析にはEnzyme-Linked Imuno Sorbent Assay（ELISA）などの免疫学的方法が用いられてきた。しかし、この方法は操作が煩雑で測定に時間を要し、加えて測定に使用する抗体試薬も高価である。そこで当研究室では、これまでに96穴プレートを用いた簡便なTHP測定法を開発・報告してきた。しかし、本法において細菌を含む尿検体を分析した際に正誤差を生じることがその後の検討において分かった。そこで、今回は本法の前処理操作に改良を加えて尿中の細菌による影響回避を試みたので報告する。
【方法】
1)細菌がTHP 測定法に与える影響について : THP を含有する菌数の異なる模擬細菌尿（大腸菌浮遊液）を作成し、菌体による本法への影響を評価した。
2)濾過フィルターを用いた細菌除去に関する検討 : 従来からの尿検体前処理法を行いTHPのみを尿検体から抽出しTSE緩衝液（10 mmol/L Tris, 1% SDS, pH 8.8, 1 mmol/L EDTA）でTHPを溶解させた後、Cosmonice Filter W(pore size 0.45 µm, 直径13 mm：ナカライテスク(株))を用いて細菌を除去し、その濾液を用いて分析を行った。また、検体の前処理にフィルター操作を組み込んだ改良後の基礎的性能評価も合わせて行った。
測定機器：マルチモードプレートリーダー(EnSight :PerkinElmer社製)を使用した。(励起波長 280 nm、検出波長 350 nm)。
【結果】
1) 従来の前処理法のみで処理した模擬細菌尿は菌数の濃度に応じてTHPの測定値に正誤差を与えた。
2)従来の前処理のみで模擬細菌尿を測定したときは誤差率が44 ％であったが、前処理後にフィルターにて濾過を行った場合は、誤差率3.72 %に留まった。
3) 前処理操作にフィルター処理を組み入れた際の本法の直線性は従来と変わらず0-150 mg/Lまでの定量特性を有しており、2濃度(20, 100 mg/L)による変動係数はそれぞれ16.2, 10.1％であった。また、検出限界と定量限界はそれぞれ5.78, 7.82 mg/Lであった。
【考察】
検体前処理にフィルター操作を組み入れた改良法により、尿中の細菌による正誤差の影響を回避し尿中THPの測定が可能となった。今後は改良法を用いて、尿路感染症患者検体を含む実試料を用いた検討を行う。
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福元沙織、香田彩華、大澤 進、外園栄作, 金属キレータNitroso-PSAPを用いた血中NAD+およびNADH測定法の開発, 生物試料分析科学会, 2023.03, 【はじめに】ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD）は、ヒトを含めたほぼすべての生物種に存在し、補酵素や基質として生体内で利用されている。現在までの研究により、NADは加齢とともに減少し、加齢に伴うNAD代謝の異常は肥満や糖尿病、アルツハイマー病などの老化関連疾患を引き起こすことが分かっている。このことから、NAD量が老化や老化関連疾患の指標となり、血中NAD量の測定によって老化の進行度を調べられる可能性があると考えられる。本研究では、金属キレート試薬Nitroso-PSAPを利用して、共存物質の影響を受けにくい長波長側検出で、より高感度なNADH測定法を構築し、血中NAD測定法の開発・検討を行うことを目的とする。
【方法】NAD+はエタノールを基質とし、アルコールデヒドロゲナーゼ（ADH）によりアルデヒドへと酸化させる反応の補酵素として作用しNADHに還元される。この反応によりNADはすべてNADH（NAD+からのNADHと内在NADHの総和）になる。
NADHは1-Methoxy PMS存在下でFe3+をFe2+に還元し、Fe2+-Nitroso-PSAP錯体（750nm）を形成するため、吸光度増加量により総NAD量の測定ができる。また、この反応機構においてADHを使用しない場合、試料中のNAD+は反応に利用されず、試料中のNADHのみが反応に使われるため、内在NADH量の測定が可能である。得られた総NAD量とNADH量の差からNAD+量を算出する。
① NADH測定法
分析機器：日立7170形自動分析装置。試薬：第一試薬（R1）：0.1 mol/L HEPES緩衝液（pH 7.0）、600 µmol/L Nitroso-PSAP含有。第二試薬（R2）：0.1 mol/L HEPES 緩衝液（pH 7.0）、500 µmol/L FeCl3、13.0 µmol/L ロッシェル塩、6.8 µmol/L 1-Methoxy PMS含有（濃度は反応液中の終濃度）。分析法：各検体量は試料/R1/R2：35/210/140 µL。測定波長は750 nm、2ポイントエンド法。測定時間は10分。
② 総NAD（NAD++NADH）測定法
分析機器：日立7170形自動分析装置。試薬：第一試薬（R1）：0.1 mol/L HEPES 緩衝液（pH 7.0）、10 U/mL ADH含有。第二試薬（R2）：0.5 mol/L TAPS 緩衝液（pH 9.0）、2 mol/L エタノール、600 µmol/L Nitroso-PSAP含有。第三試薬（R3）：0.5 mol/L HEPES 緩衝液（pH 7.0）、500 µmol/L FeCl3、13.0 µmol/L ロッシェル塩、6.8 µmol/L 1-Methoxy PMS含有。（濃度は反応液終濃度）。分析法：各検体量は試料/R1/R2/R3：35/20/210/140 µL。測定波長は750 nm、2ポイントエンド法。測定時間は10分。これら条件のもと直線性、検出限界などの基礎的性能評価を行った。
【結果】NADHおよび総NADの高感度測定法を構築した。基礎的性能評価を行ったところ、NADH測定法では直線性は500 µmol/L までみられ、検出限界は4.11 µmol/Lであった。総NAD（NAD++NADH）測定法におけるNADH水溶液を用いた場合の直線性は200 µmol/Lまでみられ、検出限界は1.14 µmol/Lであった。総NAD測定法で求めた総NAD濃度とNADH測定法で得られたNADH濃度の差からNAD+濃度を求めることができた。
【考察】本研究では各試薬の濃度やpHの検討を行い、総NAD測定法とNADH 測定法を組み合わせ、Nitroso-PSAPを用いて血中の総NAD量、NAD+、NADHを従来法より高感度な測定法の開発が可能となった。今後は、血清などの実検体を用いて、NADH測定法、総NAD測定法の臨床への応用を目指した検討を行う。
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岡本拓磨, 大澤 進，外園栄作, ペルオキシダーゼ酸化縮合発色でのTrinder試薬に含有するアルコールの除去に関する検討, 生物試料分析科学会, 2023.03, 【はじめに】
現在、飲酒の常習性を評価するためのマーカーはいくつか報告されているが、半減期の長い血球内マーカーは質量分析装置など市中病院の検査室では測定困難であるなどの問題を抱えている。そこで我々の研究室では自動分析装置を用いた血球内微量アルコール含有物質の酵素的測定法の構築を目指している。希釈溶血後のヘモグロビンの吸収は600 nm以下で大きな吸収を示すため、その検出波長は600 nmより長波長が望ましい。アルコールオキシダーゼを用いて4-アミノアンチピリン（4-AA）と酸化縮合系発色試薬を用いてペルオキシダーゼ-過酸化水素発色系による検出を行う。使用する水素供与体として生体試料からの影響を回避する目的で、630 nmの長波長域に極大吸収を持つMAOS (N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3,5-dimethylaniline)を選択して測定系の構築を試みたが、その際に経時的にブランク反応の吸光度の上昇を認めた。ブランク上昇の原因がMAOSの精製過程で使用するエタノールが原因であることが推測された。そこで今回，このMAOS内に内在するアルコールの除去を試み、ブランク上昇を抑えることが可能か検証を行い、若干の知見を得たので報告する。
【方法】
測定機器：島津UV-2550形分光光度計
試薬：緩衝液：0.2 mol/Lリン酸緩衝液(pH
7.0)・POD溶液：リン酸緩衝液にPODを5 U/mL
になるように溶解。4-AA溶液：リン酸緩衝
液に4-AAが50 mmol/Lになるように溶解。
MAOS溶液：リン酸緩衝液にMAOSが0.1
mmol/Lとなるように溶解。アルコールオキ
シーゼ(AOD)溶液：リン酸緩衝液にAODが5
U/mLになるように溶解。
分光光度計を用いてPOD溶液3.0 mL、4-AA溶液0.5 mL、MAOS溶液0.5 mLを混和した後、4.9 mmol/L H2O2 50 µLを添加し37℃,5分反応させた。上記の操作法で各MAOSの処理条件ごとの吸収曲線とH2O2への反応性を確認した。検討には処理を施した以下のMAOSを用いた。
・A-MAOS：水に溶解後98℃に加熱し凍結乾燥
・B-MAOS：A-MAOSと同様の操作を2回施行
・a-MAOS：粉末状のMAOSを98℃に加熱し凍
結乾燥
・N-MAOS：未処理のMAOS
凍結乾燥は、エバポレーターを用いて真空条件下において水分を蒸発させた．乾燥後の粉末状のMAOSは-80℃にて遮光保存した。
【結果】
各種処理条件下におけるMAOS発色の極大吸収波長はすべて630 nmに認めた。リン酸緩衝液にAODを加えた時の極大吸収波長も630 nmに観察され、未処理のN-MAOSの吸光度は他の処理MAOSと比べ僅かに高かった。酵素反応タイムコースを確認するとN-MAOSでは経時的吸光度上昇が観察されたが、各処理を加えたMAOSでは、その上昇は観察されなかった。
【考察】
加熱・凍結乾燥の各処理を施すことによるMAOSの反応性に差異は見られず、精製過程で混入したと考えられた内在アルコールを除去でき、ブランクの上昇を抑えることが可能であった。試薬利用で製造過程での混入物に関する情報について利用者は普段あまり意識することはないが、思わぬ形で反応に影響を与えることがあることも念頭におくべきである。
しかし、この測定法は高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を必要とし、測定時間も1検体30分と時間を要する。そこで本研究では、容易に入手可能な試薬である硫酸アンモニウム、塩化ナトリウムを用いて尿サンプルを前処理し、THPのみを分離するという安価で迅速・簡便なTHP測定法の確立を目指し検討を行ったので報告する。
【原理】塩析によりTHPのみを分離する。尿サンプルに硫酸アンモニウム、塩化ナトリウムを加えることでTHPを凝集、沈殿させ、上清を捨てる。残ったTHPの沈殿を精製水に溶解させる。この洗い操作を2回繰り返し、分離したTHPを蛍光検出によって定量する。
【方法】本測定系の測定試薬および測定条件は以下のとおりである。
前処理試薬：15％硫酸アンモニウム、72.5 mmol/L 塩化ナトリウム
尿サンプル500 µLに前処理試薬500 µLを加え、10分混和後、20,000 gで10分遠心。上清を除去した後に500 µLの精製水を添加。完全にTHPを溶解させ、同様の操作をもう1度繰り返す。最後に沈殿となったTHPをTSEバッファー（10 mmol/L Tris, 1 mmol/L EDTA, 1% (w/v) SDS, pH 8.8）にて完全に溶解させEx/Em＝280/325 nmで検出。
【結果】1) 再現性、直線性：Mean±SD=401.4±0.95 mg/Lの尿サンプルにおける同時再現性(n=10)は、CV=3%以下であった。また100 mg/Lまでの原点を通る直線を確認した。2) 検出感度：THP標準物質を用いた±2 SD法による最小検出感度は、3 mg/Lであった。3) 添加回収試験：添加回収率は95-105％と良好な回収率を示した。
【結論】本測定法は、塩析の原理を用いた非常に安価で簡便なTHPの分離・測定法であり、従来問題とされていた測定時間の長さや試薬のコストなどを大幅に改善することができた。今後は実検体を用いて、腎疾患における臨床的意義の検討を行いたい。. |
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深川 結妃,外園 栄作, 私が目指す臨床検査技師像, 第56回日臨技九州支部医学検査学会, 2022.11, [過去]
私は小学生の時の祖母の入院・手術を通して、検体や生体から目に見えない病態を数値化・画像化して考察する臨床検査技師の仕事に魅力を感じ大学へ進学しました。 そして、大学での講義や実習で検査技術の基礎を学び、九州大学病院での臨地実習、卒業研究を経て、臨床検査技師国家資格を取得することができました。
[現在]
今、私は臨床化学に関する検査法をさらに学ぶために、大学院で現行の検査法を改良した新たな測定系の開発を目指し研究を行っています。実験では理想の結果が得られず悩む事もよくありますが、時には先生や友人からのアドバイスを頂きながら得られた実験結果をしっかりと整理し、問題解決に取り組んでいます。私は、研究の過程で必要な「探求心を持って物事に向かい、得られた結果に対してしっかりと考察する姿勢」は臨床検査技師にとっても非常に大切な事だと考えています。
[将来]
大学院卒業後、私は臨床の場に出て、検査におけるいろいろな経験を積むことがまずは大切であると考えています。その中で、検査技師として検体や検査法の観点から分析法や症例などについても興味を持って日々の検査に向き合っていきと思っています。
「探求心を持って思考する姿勢」を意識して「検体や患者さんの異常に最も早く気付ける存在」として患者さんに寄り添える技師が私の理想に掲げる臨床検査技師像です。そして、その先には、検査のプロフェッショナル、次世代のリーダーとして他の医療従事者との連携を軸にチーム医療全体に貢献できる人材を目指します。
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村上匡史 、細井昌子 、外園栄作、安野広三 、田中佑、藤本晃嗣、柴田舞欧、須藤信行, 尿中オキシトシン濃度が神経障害性疼痛に与える影響について, 第26回日本心療内科学会総会・学術大会, 2022.11, 【目的】
直接ビリルビンを測定する方法としては安価であるバナジン酸を用いた化学的酸化法が多くの施設で利用されている。しかし、この化学的酸化法の直接ビリルビン値には抱合型ビリルビンに加え、δ-ビリルビンを測り込む問題がある。このことは臨床において、血中アルブミンと共有結合したδ-ビリルビンが長期的に血中に残存し、閉塞性黄疸の減黄期において、抱合型ビリルビン(C-Bil)が低下しているにも関わらず、直接ビリルビン値が依然として高値を示すことから、臨床所見とデータとの乖離の原因となっていた。そこで、本検討ではδ-ビリルビンを測り込まない抱合型ビリルビン特異的化学的酸化法の開発を目指し、若干の知見を得たので報告する。
【方法】
本検討では、日立7600形自動分析装置を用いて、試料20 µL、δ-ビリルビンへの反応低減物質Aを含む第一試薬 130 µLと約2.５分反応させた後に270 µL酒石酸緩衝液を第二試薬、70 µLバナジン酸含有溶液を第三試薬として、測定波長(主/副): 450/546 nm、2 point-rate assayにて分析し、基礎的性能評価を行った。
【結果】
本法における併行精度は低・中・高濃度においていずれもCV 4 %以下と良好な結果となった(n=10)。直線性は26.3 mg/dLまで確認でき、δ-ビリルビンを含まない試料での本法と現行バナジン酸酸化法(n=20)およびHPLC法(n=10)との相関はそれぞれr=0.998、0.995といずれも良好な結果であった。血清にジタウロビリルビン添加した添加回収率は103 %と良好な結果となった。また、δ-ビリルビンへの反応性は現行のバナジン酸酸化法と比べ約74 %抑えることが可能であった。
【考察】
本法では現行法と比べてδ-ビリルビンへの反応を大きく抑制することが可能であり、抱合型ビリルビンに対してより特異性が向上した測定法となったと考えている。今後、更なる特異性の向上とさまざまな臨床検体を用いて、実試料に対する基礎的性能評価や測定原理の異なる他法との比較を検討したいと考えている。. |
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岡本 拓磨、大澤 進、外園 栄作, 抱合型ビリルビンの特異的な化学的酸化法開発の試み, 第54回日本医療検査化学会, 2022.10, 【目的】
直接ビリルビンを測定する方法としては安価であるバナジン酸を用いた化学的酸化法が多くの施設で利用されている。しかし、この化学的酸化法の直接ビリルビン値には抱合型ビリルビンに加え、δ-ビリルビンを測り込む問題がある。このことは臨床において、血中アルブミンと共有結合したδ-ビリルビンが長期的に血中に残存し、閉塞性黄疸の減黄期において、抱合型ビリルビン(C-Bil)が低下しているにも関わらず、直接ビリルビン値が依然として高値を示すことから、臨床所見とデータとの乖離の原因となっていた。そこで、本検討ではδ-ビリルビンを測り込まない抱合型ビリルビン特異的化学的酸化法の開発を目指し、若干の知見を得たので報告する。
【方法】
本検討では、日立7600形自動分析装置を用いて、試料20 µL、δ-ビリルビンへの反応低減物質Aを含む第一試薬 130 µLと約2.５分反応させた後に270 µL酒石酸緩衝液を第二試薬、70 µLバナジン酸含有溶液を第三試薬として、測定波長(主/副): 450/546 nm、2 point-rate assayにて分析し、基礎的性能評価を行った。
【結果】
本法における併行精度は低・中・高濃度においていずれもCV 4 %以下と良好な結果となった(n=10)。直線性は26.3 mg/dLまで確認でき、δ-ビリルビンを含まない試料での本法と現行バナジン酸酸化法(n=20)およびHPLC法(n=10)との相関はそれぞれr=0.998、0.995といずれも良好な結果であった。血清にジタウロビリルビン添加した添加回収率は103 %と良好な結果となった。また、δ-ビリルビンへの反応性は現行のバナジン酸酸化法と比べ約74 %抑えることが可能であった。
【考察】
本法では現行法と比べてδ-ビリルビンへの反応を大きく抑制することが可能であり、抱合型ビリルビンに対してより特異性が向上した測定法となったと考えている。今後、更なる特異性の向上とさまざまな臨床検体を用いて、実試料に対する基礎的性能評価や測定原理の異なる他法との比較を検討したいと考えている。
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福元 沙織、大澤 進、外園栄作, 核酸増幅過程における副産物ピロリン酸の高感度検出技 術の開発および核酸増幅後試料への応用, 第54回日本医療検査化学会, 2022.10, 【目的】核酸増幅技術は、細菌やウイルスの感染検査や、がんの診断を行う目的で利用され、蛍 光プローブを用いた検出法が主流である。しかし、この検出法においては励起や蛍光検出に伴う 特殊な装置や高価な蛍光試薬が必須となる。そこで本研究では、核酸増幅過程で生成されるピロ リン酸を、特別な機器を必要とせず酵素を用いて可視領域において高感度に検出可能な簡便で迅 速な核酸増幅量の検出技術の開発を試みた。 【測定原理】核酸増幅過程で生成するピロリン酸にヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェ ラーゼ(HPT)、キサンチンオキシダーゼ(XOD)を作用させ、過酸化水素を生成させる。さらに、二 価鉄および5-Br-PAPSを添加し、形成された錯体の呈色を検出する。 【方法】分析機器:日立7170形自動分析装置および日立分光光度計U-2810。試薬:第一試薬 (R1):pH 8.0, 50 mmol/L Tris-HCl、0.4 kU/L HPT、2.5 kU/L XOD、1.0 mmol/L塩化マグネシ ウム、0.25 mmol/Lイノシン-5'-リン酸含有。第二試薬(R2):pH 3.0, 1.0 mol/Lギ酸緩衝液、 200 μmol/L硫酸鉄、100 μmol/L 5-Br-PAPS含有(濃度は反応液中を意味する)。試料:ピロリン 酸ナトリウム水溶液。分析法:各検体量は試料/R1/R2:5/110/60 μL。測定波長(主/副)は 600/800 nm、2 point-end assay。これらの条件のもと基礎的性能評価および本法により核酸増 幅後試料中のピロリン酸の測定を行った。 【結果】本法のモル吸光係数は、通常の過酸化水素検出系と比較して約10倍高感度にピロリン酸 を検出できた。直線性は1.0 μmol/Lまで確認でき、併行精度試験では、低・中・高濃度のいずれ の濃度においても変動係数(C.V.)1.25 %以下となった(n = 20)。また、実際の核酸増幅後の試料 においてピロリン酸を検出可能であった。 【結論】本法において、核酸増幅過程で生成されるピロリン酸を、酵素法と錯体呈色反応に導く ことで核酸増幅の有無を簡便に可視化・定量できる可能性が見出された。. |
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福元沙織、内海 健、外園栄作, 核酸増幅過程の副産物ピロリン酸の高感度検出技術に関する検討, 第61回日本臨床化学会年次学術集会, 2021.11, 【背景】遺伝子検査における核酸増幅技術は、細菌やウイルスの感染の検査や、がんの診断を行う目的で用いられ、臨床検査において今後更にその用途は拡大すると予想される。現在までに既に各社から核酸増幅法が考案されているが、その増幅検出技術においては、核酸増幅時の副産物ピロリン酸を蛍光プローブ等にて検出する方法が主流となっている。しかし、この検出法では励起装置や蛍光検出器など特殊な装置や高価な蛍光試薬が必要となる。遺伝子検査において、特に細菌やウイルス感染の有無を検査する際には、短時間で検査結果を得ることができる迅速性と、緊急時においても測定ができる簡便性が重要である。そこで本研究では、核酸増幅過程で生成されるピロリン酸を、酵素を用いて可視領域において高感度に検出することで、特別な機器を必要としない、より簡便で迅速な核酸増幅量の検出技術の開発を試みた。
【測定原理】核酸増幅過程で生成するピロリン酸にヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（HPT）、キサンチンオキシダーゼ（XOD）を作用させ過酸化水素（H2O2）を生成させる。さらに、金属および金属キレーターを添加し、形成された過酸化水素・金属・金属キレーターの錯体形成による発色を600 nmにて呈色・検出する。
【方法】ピロリン酸ナトリウム水溶液を試料とし、金属および金属キレーターとしてはそれぞれ二価鉄と5-Br-PAPSを用いた。第一試薬（R1）の緩衝液には、酵素の至適pHを考慮してpH 8.0, 50 mmol/L Tris-HClを用い、各試薬濃度は0.4 kU/L HPT、2.5 kU/L XOD、1.0 mmol/L塩化マグネシウム、0.25 mmol/Lイノシン-5'-リン酸とした。第二試薬（R2）の緩衝液は、過酸化水素・二価鉄・5-Br-PAPSの錯体形成反応が起こる至適pHを考慮してpH 3, 1.0 mol/Lギ酸緩衝液を用い、各試薬濃度は200 µmol/L硫酸鉄、100 µmol/L5-Br-PAPSとした。これら条件のもと直線性、併行精度などの基礎的性能評価を行った。分析には日立7170形自動分析装置および日立分光光度計U-2810を用いた。分析法は2 point-end assay、測定波長（主/副）は600/800 nm、各検体量は試料/R1/R2：5/110/60 µL、反応温度は37℃、測定時間は10分とした。（濃度については全て反応終液中を意味する）
【結果および考察】
0.5 µmol/Lピロリン酸ナトリウム水溶液を用いて算出した本法におけるモル吸光係数は、通常の過酸化水素検出系と比較して約10倍高感度にピロリン酸を検出できた。直線性は1.0 µmol/Lまで確認でき、0.1、0.5、1.0 µmol/Lの濃度のピロリン酸ナトリウム水溶液を用いた併行精度試験では、いずれの濃度においても変動係数（C.V.）1.3 %以下であり、良好な再現性が確認できた（n = 20）。
【結論】核酸増幅過程の副産物であるピロリン酸を、XODを用いた酵素的測定法における検出を試み、二価鉄および5-Br-PAPSを用いて可視領域において高感度に検出できることが確認できた。今後は、核酸増幅後の試料を用いた測定を行い、本測定技術の臨床検査への応用の可能性を検証し、核酸増幅量の検出技術の確立を目指す。
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福元沙織、内海 健、外園栄作, Br-PAPSを用いた過酸化水素高感度検出における基礎的検討, 第61回日本臨床化学会年次学術集会, 2021.11, 【背景】現在、臨床検査における酵素法を原理とした測定法において、酸化酵素の作用により過酸化水素（H2O2）を生成させ、過酸化水素、4-Aminoantipyrine（4-AA）、トリンダー試薬をペルオキシダーゼ（POD）により酸化縮合させ生成した色原体の呈色を検出する方法が広く用いられている。この測定系は酸化縮合反応を利用していることから、試料中に含まれる還元物質の妨害を強く受けることが知られている。そこで本研究では、過酸化水素・金属・金属キレーターの錯体形成による発色を利用して酸性条件下において直接的に過酸化水素を定量することにより、生体試料中の還元物質などの成分から影響を受けにくく、現行のPOD発色法よりも高感度でかつ、特異性の高い新しい検出技術の開発を試みた。
【方法】過酸化水素を試料に用い、金属として二価の鉄イオン、金属キレーターとして5-Br-PAPSを添加して、過酸化水素・鉄・Br-PAPSの錯体形成反応が起こる至適pH、至適金属および金属キレーター濃度条件を検討し、直線性、併行精度などの基礎的性能評価を行った。さらに、試料に還元物質としてアスコルビン酸を添加して、還元物質の影響を検証した。分析機器は日立7600形自動分析装置および日立分光光度計U-2810を用いた。分析法は2ポイントエンド、測定波長（主/副）は600/800 nm、各検体量は試料/第一試薬/第二試薬は20/200/20 µL、反応温度は37℃、測定時間は10分とした。
【結果および考察】至適pHはpH 3.0であり、鉄イオン終濃度200 µmol/Lおよび5-Br-PAPS終濃度100 µmol/Lの組み合わせにおいて、最も高感度に過酸化水素を検出できた。直線性は1.5 µmol/Lまで確認でき、0.25、0.5、1.0 µmol/Lの3濃度の過酸化水素溶液を用いた併行精度試験では、いずれの濃度においても変動係数(C.V.) 3.4 %以下であり、良好な再現性が確認できた（n = 10）。また、1.0 µmol/L過酸化水素溶液を用いて求めた本法におけるモル吸光係数は、現行法のPOD検出系よりも10倍以上の高感度で過酸化水素を検出できた。また、アスコルビン酸オキシダーゼを添加することで50 mg/dLアスコルビン酸濃度までの影響を回避することができた。
【結語】生体中の還元物質の影響を受けにくい過酸化水素の高感度検出技術の開発を試み、5-Br-PAPSおよび鉄を用いて過酸化水素の高感度な検出の可能性を見出すことができた。今後は、他の還元物質の影響試験や血清などの実試料を用いる事でより実践的な検討を行い、生体試料中の還元物質の影響を回避した高感度検出技術の確立を目指す。. |
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林 麟太郎、内海健、外園栄作, マイクロプレートを用いたTamm-Horsfall Protein測定法に関する検 討-尿中細菌が分析に与える影響について-, 第53回日本医療検査化学会, 2021.10, [目的]
Tamm-Horsfall Protein(THP)は健常者尿中に排泄され る蛋白のうち約5 0 %を占める糖蛋白質の一種であり、遠位 尿細管ヘンレループ上皮細胞で産生・放出され、円柱の主 成分として知られている。これまでに、T H P 産生遺伝子欠 損マウスの膀胱内に大腸菌を注入した実験で、健常なマウ スと比べて大腸菌の感染定着率が増大したとの報告がある が、ヒトの尿路感染症における感染程度とT H P 排泄量に関 する報告はない。そこで本研究では、尿路感染と尿中T H P 排泄量の関連性について検討し、T H P 排泄が感染防御にど のように関わるかを明らかにすることを目的とする。今回 は、現在までに構築したマイクロプレートを用いた簡易測 定法において尿中の細菌が分析に与える影響を調べ、その 影響の回避法について検討を行ったので報告する。
[方法]
1)T H P 測定法の基礎的検討:同時再現性及び定量直線性の 検討。
2 )細菌がT H P 測定法あたえる影響について:T H P を含有す る大腸菌浮遊液を作成し、菌体による分析への影響の有無 を検証した。
3)フィルターを用いた検討:Cosmonice Filter W(ナカラ イテスク(株))を使用し分析の改善を試みた。測定機器は マルチプレートリーダー(PerkinElmer EnSight)を使用 した(励起波長280 nm、検出波長350 nm)。
[結果]
1)2 0 0 m g /Lまでの定量直線性を確認でき、2 濃度(10 0 m g /L, 2 0 0 m g /L)による変動係数はいずれも約5 % 以内と良好で あった。
2 )菌浮遊液に含まれる大腸菌はT H P 測定法の条件下で測り こまれ、約12 % の正誤差を与えた。 3)フィルターを介した改善策では約5 %程度まで正誤差を 改善できた。
[考察] 今回の測定では精製水をベースに細菌を混和した模擬細菌 尿を用いての検討であったが、今後は改善法を用いて尿路 感染症患者の実際の細菌含有検体を用いて、検証を行う予 定である。そして、尿中T H P 排泄量測定の臨床的意義につ いて検証を行う予定である。. |
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後藤大希、内海健、外園栄作, ニッケル-ビウレット法を基本原理とするクロムアズロールBを用いた尿中総蛋白測定法の開発, 第32回日本臨床化学会（第66回日本臨床検査医学会 九州地方会合同開催）, 2021.03, 緒言
現在，蛋白尿の検査は試験紙法やピロガロールレッド法が臨床で用いられている．しかしながら，これらの検査法はアルブミンに対しては特異的であるがアルブミン以外の蛋白に対して反応性が低いことが問題となっており，アルブミン以外の蛋白が出現する病態を見逃している可能性がある．そこで本研究は蛋白間差が少なく微量蛋白を測定可能な試薬開発を目的とし，そのための試薬組成の検討および試薬の基礎的性能評価を行った．
原理
本法は第一反応において強アルカリ条件下で，ニッケルと蛋白を反応させ二次元錯体を形成させる．第二反応において，形成した二次元錯体に対してニッケルに特異的な金属キレート剤であるChromeazurol B(CAB)を反応させることにより三次元錯体を形成させ，これを呈色反応へと導く．
結果
基礎的性能評価の結果より概ね良好な結果を得られたが，改善すべき点も挙がった．相関試験では相関係数がPR法，HPLC法ともに0.989となり良好な相関関係を得られた．本法はPR法よりもアルブミン以外の蛋白に対する反応性も向上し，尿細管障害の指標であるβ2-ミクログロブリンとの反応性は大きく改善された．また本法のモル吸光係数が250万(L/mol・cm)となりPR法の100万(L/mol・cm)よりも高感度な測定法となった．
結語
現行法であるPR法と比較して本法は，各種蛋白に対する反応性を大きく改善させたほか，感度も向上することができた．基礎的性能評価の結果において，低濃度域における精度の改善，尿中のアスコルビン酸の影響回避など改善すべき幾つかの点が挙がったが，今後更に，これらの問題点を改善し，様々な病態における蛋白尿の検出に有効な検出法として，研究や臨床の現場において広く利用される測定法を目指したい．. |
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山本 祥輝, 赤田 泰崇, 原口 泰典, 後藤 大希,村井 雅樹, 外園 栄作, 内海 健, 栢森 裕三
, 新規ロイコ系色素における光安定性の検証とピルビン酸測定法への試み, 日本臨床検査自動化学会, 2019.10, [目的]
臨床検査分野における生体成分の測定法は, 緩和な条件で特異性の高い酵素を利用した測定法が主流を占めている. その酵素法の検出法として今までに様々な高感度検出系が開発されてきたが, 多様な濃度範囲のある生体成分を高感度に, しかも正確に測定するためには十分ではない場合がある. そこで検出系のなかでも比較的高感度な測定が行える, ロイコ系色素を使用した方法に着目した．この色素の一部は臨床検査においてキット化され日常検査法としても利用されていたが, 試薬の安定性, 特に光による自然発色の問題が指摘され, 感度が良いにもかかわらず現在では一部の試薬に応用されているに過ぎない. 今回, 新しく開発された新規ロイコ系色素について, 従来から利用されているDA-67を対照として安定性等の基礎的検討とピルビン酸分析に向けた測定法への応用検討を行ったので報告する.
[検討内容・測定機器]
1) ロイコ系色素の基礎的検討
比較対照色素: DA-67, 検討色素: KN-304 (新規ロイコ系色素)
2) 光による安定性試験
常温暴露, 常温遮光, 冷蔵遮光の3条件において, DA-67を対照にKN-304
の光に対する安定性について検討した.
3) ピルビン酸測定への応用
生体試料中において微量成分であるピルビン酸を分析対象とした測
定法への応用を試みた.
4) 測定機器
日立7600形自動分析装置 (日立ハイテクノロジーズ（株）)
日立分光光度計U-2810(日立ハイテクノロジーズ（株）)
[結果]
KN-304の極大吸収波長は, DA-67と同様に660 nmであった. DA-67と比較
して, KN-304は光に対して安定であった.ピルビン酸水溶液を試料に用い
た感度の比較検討では, DA-67とKN-304の両者において同等であった.
[結論]
DA-67とKN-304を比較検討した結果, KN-304は高感度な測定が可能な
DA-67とほぼ同等の感度を有し, ピルビン酸の測定法に応用が可能で,
なおかつDA-67よりも光に対して安定であった. 今後, 更なる臨床検査の
検出系としての有用性について検証したい.
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原口泰典， 赤田 泰崇, ＃山本 祥輝， 後藤 大希, 東中尾 愛， 外園 栄作, 内海 健, 栢森 裕三, 酵素サイクリング法を用いたクレアチニンの高感度測定法（その5）, 日本臨床検査自動化学会, 2019.10, [目的]
クレアチニンは筋肉の代謝反応におけるクレアチンリン酸の最終代謝産物である．血中クレアチニンは腎糸球体で濾過されるが，尿細管にて再吸収されないため，そのまま尿中に排出される．そのため糸球体濾過率が低下した場合,血清クレアチニン濃度が高くなる．腎機能の指標として使用されているeGFR（推算糸球体濾過率）を計算する際に年齢と血清クレアチニン濃度を利用する．日本腎臓学会慢性腎臓病対策委員会では推算式に用いる血清クレアチニン濃度値を小数点以下二桁まで代入することを推奨している．しかし，現在,臨床で汎用されている酵素法やJaffe法では検出限界が大きく，小数点2桁以下まで正確に測定できているとはいえない．これらの問題点を解消すべく,本研究室ではこれまで0.01 mg/dL以下となる検出限界の測定を目標に酵素サイクリング法を用いたクレアチン測定法の開発・報告をおこなってきた（2018 日本医学検査学会, 東京）．今回はさらに内因性アンモニア消去能についての検証や実試料を用いた市販試薬との相関試験について検討を行ったので報告する．
[試薬濃度]
第一試薬（R-1）：45 mmol/L HEPES緩衝液（pH 7.5），43.2 kU/L LD，80 µmol/L 1-methoxy PMS，0.4 mmol/L WST-8，36 mmol/L MgCl2，80 mmol/L L-グルタミン酸ナトリウム，1.5 mmol/L ATP，2 kU/L GS，1.2% (W/V) TritonX-405
第二試薬（R-2）：390 mmol/L Tris-HCl緩衝液（pH 9.0），300 mmol/L L-乳酸リチウム，36 mmol/L MgCl2，80 mmol/L L-グルタミン酸ナトリウム，1.5 mmol/L ATP，2 kU/L GS，2 kU/L CD，0.8 mmol/L AMP
[分析機器及び条件]
日立7600形自動分析装置（日立ハイテクノロジーズ（株））を用いて測定した．試料（8 µL）とR-1（µL）を混和し，5分間反応させ，その後R-2(µL)を混和し，5分間反応させ，反応後の21-25ポイントでの吸光度を測光波長450 nm (主) / 800 nm (副)で測定した．同様に測定した標準物質の吸光度変化量をもとに試料中のクレアチン濃度を算出した.
[結論]
本測定法はアンモニア等の干渉物質の影響を回避でき，CVは3%以下と良好な結果が得られ，実試料を用いた市販試薬と強い正の相関があることが確認できた．今後はさらに各種疾患を有した臨床検体を測定することで，より低濃度までの検出感度を有した本法の臨床的有用性について検証する予定である．. |
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赤田 泰崇， 保坂 洸喜， 川満 紀子， 秋本 卓， 酒本 美由紀, 堀田 多恵子，康 東天， 栢森 裕三， 外園 栄作
, 迅速・簡便な尿中Tamm-Horsfall Protein(THP)測定法およびその臨床的意義の検討, 生物試料分析科学会, 2019.02, 【目的】Tamm-Horsfall Protein (THP)は1950年にTammとHorsfallにより報告された健常人の尿中に最も多く排泄される糖タンパク質である。このTHPは、ウイルスの血球凝集反応を抑制する性質を持ち、現在までにその尿中排泄量は様々な腎疾患との関連が示されている。近年では特に尿路結石症との関係が注目されている。THPの単分子量は約85～100 kDaであるが、尿中のNa+、 Cl－などの塩類の濃度上昇や尿浸透圧、尿の酸性化などの因子により、重合・凝集し分子量2800万もの高分子を形成することもある。現在、THPの測定法は主にELISAなどの免疫学的測定法で行われているが、上記のTHPの重合・凝集の性質により抗原抗体反応が阻害され、特に低濃度域におけるTHPを正確に測定することは難しい。また、試薬が高価であり、操作が煩雑で測定に長時間を要する。このような問題点を解決するために、当研究室の秋本は高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を用いたTHPの高感度測定法を開発・報告した。
しかし、この測定法は高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を必要とし、測定時間も1検体30分と時間を要する。そこで本研究では、容易に入手可能な試薬である硫酸アンモニウム、塩化ナトリウムを用いて尿サンプルを前処理し、THPのみを分離するという安価で迅速・簡便なTHP測定法の確立を目指し検討を行ったので報告する。
【原理】塩析によりTHPのみを分離する。尿サンプルに硫酸アンモニウム、塩化ナトリウムを加えることでTHPを凝集、沈殿させ、上清を捨てる。残ったTHPの沈殿を精製水に溶解させる。この洗い操作を2回繰り返し、分離したTHPを蛍光検出によって定量する。
【方法】本測定系の測定試薬および測定条件は以下のとおりである。
前処理試薬：15％硫酸アンモニウム、72.5 mmol/L 塩化ナトリウム
尿サンプル500 µLに前処理試薬500 µLを加え、10分混和後、20,000 gで10分遠心。上清を除去した後に500 µLの精製水を添加。完全にTHPを溶解させ、同様の操作をもう1度繰り返す。最後に沈殿となったTHPをTSEバッファー（10 mmol/L Tris, 1 mmol/L EDTA, 1% (w/v) SDS, pH 8.8）にて完全に溶解させEx/Em＝280/325 nmで検出。
【結果】1) 再現性、直線性：Mean±SD=401.4±0.95 mg/Lの尿サンプルにおける同時再現性(n=10)は、CV=3%以下であった。また100 mg/Lまでの原点を通る直線を確認した。2) 検出感度：THP標準物質を用いた±2 SD法による最小検出感度は、3 mg/Lであった。3) 添加回収試験：添加回収率は95-105％と良好な回収率を示した。
【結論】本測定法は、塩析の原理を用いた非常に安価で簡便なTHPの分離・測定法であり、従来問題とされていた測定時間の長さや試薬のコストなどを大幅に改善することができた。今後は実検体を用いて、腎疾患における臨床的意義の検討を行いたい。
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原口泰典， 東中尾愛, 立石多貴子， 河野弥季, 外園栄作， 栢森裕三, 酵素サイクリング法を用いたクレアチニンの高感度測定法（その４）, 日本臨床検査医学会, 2018.11, [目的]
クレアチニンは筋肉の代謝反応におけるクレアチンリン酸の最終代謝産物である．血中のクレアチニンは腎糸球体で濾過されるが，尿細管にて再吸収されないため，そのまま尿中に排出される．腎機能が低下した場合．腎糸球体で濾過されず，血清クレアチニン濃度が高くなる．そのため，腎機能の指標として使用されているeGFR（推算糸球体濾過量）を計算する際に年齢と血清クレアチニン濃度を利用する．日本腎臓学会慢性腎臓病対策委員会では代入する血清クレアチニン濃度を小数点以下二桁まで代入することを推奨している．しかし，臨床の現場で汎用されている酵素法やJaffe法では定量限界が大きく，小数点2桁以下まで正確に測定できているとはいえない．本研究では酵素サイクリング反応を用い、定量限界が0.01 mg/dL以下となる測定法を開発し、報告してきた. 今回は酵素サイクリング反応を用いた高感度な血清Cr測定法の基礎的データについて報告する．
[試薬濃度]
第一試薬
45 mmol/L HEPES緩衝液（pH 7.5），43.2 kU/L乳酸脱水素酵素，80 µmol/L 1-methoxy PMS，0.4 mmol/L WST-8，36 mmol/L MgCl2，80 mmol/L L-グルタミン酸ナトリウム，1.5 mmol/L ATP，2 kU/L glutamine synthetase，3.5 kU/L NAD synthetase, 1.2% (W/V) TritonX-405
第二試薬
390 mmol/L Tris-HCl緩衝液（pH 9.0），300 mmol/L L-乳酸リチウム，36 mmol/L MgCl2，80 mmol/L L-グルタミン酸ナトリウム，1.5 mmol/L ATP，2 kU/L glutamine synthetase，25 kU/L creatinine deiminase，0.8 mmol/L AMP
[測定条件]
日立7600形自動分析装置を用いて測定した．サンプルと第一試薬を混和し，5分間反応させ，その後第二試薬混和し，5分間反応させ，反応後の21-25ポイントでの吸光度を測定波長450 nm (主) / 800 nm (副)で測定した．同様に測定した標準物質の吸光度変化量をもとに試料中のCr濃度を測定した.
[結果]
同時再現性は良好であり、日差再現性は5日間程度安定していた. 直線性は200 µmol/L（2.26 mg/dL相当）まで確認でき，定量限界も1 mol/L（0.01 mg/dL相当）まで測定することができた．
[結語]
今後は，更なる高感度化や試薬安定性、市販試薬との相関性等の確認を行っていく予定である．
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清宮 正徳, 佐藤 有華, 吉田 俊彦, 澤部 祐司, 外園 栄作, 松下 一之, 大澤 進, 生化学自動分析装置を用いたインドシアニングリー測定法の検討, 日本臨床検査自動化学会, 2018.10. |
| 29. |
河野 弥季, 清宮 正徳, 外園 栄作, 栢森 裕三, 大澤 進, エタノールアミンリン酸の高感度測定法の開発（第３報）, 日本臨床検査自動化学会, 2018.10. |
| 30. |
後藤 大希， 山浦 沙樹， 酒瀬川 信一， 河野 弥季, 立石 多貴子, 眞部 正弘, 松井 啓隆, 外園 栄作, 栢森 裕三, 新規Lp-PLA2測定試薬を用いたLp-PLA2の基礎的検討, 日本臨床検査自動化学会, 2018.10, [背景・目的]
Lp-PLA₂はPLA₂familyの1つであり、PAF-AH(Platelet-activating factor acetylhydrolase)とも呼ばれ、PAFのsn-２位のアセチル基を加水分解してPAFを不活化し、リゾリン脂質を生成する。Lp-PLA₂は血漿中では約2/3 がLDL (低比重リポタンパク) と結合し存在している。Lp-PLA₂の測定する意義は、アテローム性動脈硬化や脳卒中、大腸癌などの疾患との関係性があるといわれており、これらの疾患のマーカーとして有用性が指摘されている。
本研究では新たに開発されたLp-PLA₂測定試薬を利用し、Lp-PLA2についての検討を行った。
[方法]
測定機器：日立7600形自動分析装置（日立ハイテクノロジーズ）
測定条件：血清検体:4 μLとR1:160 μLを混合し，37℃で5分間インキュベーション後、R2: 40 μLを加えて5分後までの吸光度を測定し、レート法で30から33ポイントまでの吸光度変化量を主波長546 nm，副波長660 nmで測定する。標準物質も同様に測定し吸光度変化量から試料濃度を測定する。
[結果・考察]
血液中のLp-PLA2の2/3がLDL-コレステロールと結合することから脂質関連項目との相関関係を検討し、LDL-コレステロールと総コレステロールに相関性がみられた。
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| 31. |
Eisaku Hokazono, Kouki Hosaka, Masaru Akimoto, Noriko Kawamitsu, Miyuki Sakemoto, Miki Kawano, Takiko Tateishi, Yoshihiro Mizoguchi , Masaru Omori, Taeko Hotta, Dongchon Kang, Yuzo Kayamori, Can urinary Tamm-Horsfall protein estimation predict the presence of a urinary cast?
, International Federation of Biomedical Laboratory Science, 2018.09, Background: Tamm-Horsfall protein (THP) was first characterized by Tamm and Horsfall as an inhibitor of hemagglutination. THP is synthesized in the thick ascending limb of the loop of Henle and is the most abundant protein in human urine, excreted at an average rate of 50–100 mg/day. An increase or reduction in the excretion of urinary THP indicates various clinical conditions and diseases. This protein is known as a substrate of urinary casts. The formation of urinary casts suggests various clinical conditions in an individual. We often experience the presence of not a few hyaline casts in approximately 8% of dipstick-negative urine samples: these samples are usually not subjected to microscopic examination. Therefore, the present study aimed to determine whether the estimation of urinary THP could predict the presence of urinary casts.
Method: THP was isolated from urine by salting out: 15% (NH4)2SO4 and 72.5 mmol/L sodium chloride were added to 500 µL of urine sample. THP in the urine sample was detected at Ex/Em=280/325 nm via spectrofluorometry. Urine samples were divided into 2 groups: group A, healthy subject (male: female = 26: 21, Urine protein(-), Cast(-)), group B is disease subject (male: female = 5: 7, eGFR>60, Urine protein(-), Cast(+)). Thereafter, we compared THP levels between groups A and B via the Mann-Whitney U test.
Result: The reference standard interval for urinary THP in healthy female subjects (n = 21) was 28.2–82.6 mg/g•Cre. THP range was significantly higher in women than in healthy men (n = 26; 12.7-55.2 mg/g•Cre) (p<0.01). Furthermore, THP levels were significantly different between groups A and B among men (p<0.05, Area Under the Curve [AUC]: 0.854). THP levels were slightly but not significantly higher in group B than in group A among women not (p= 0.19, AUC: 0.691).
Conclusion: The present results indicate that urinary THP levels tend to increase in accordance with the situation of cast appearance. We intend to determine the cause of differences between men and women in more detail in future studies.
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| 32. |
Miki Kawano, Eisaku Hokazono, Masanori Seimiya, Susumu Osawa, Development of Enzymatic Measuring Method of Ethanolamine Phosphate (part 3), International Federation of Biomedical Laboratory Science, 2018.09, BACKGROUND: Manic-depressive illness is a serious problem in Japan. Therefore, it’s very important to find and treat the disease early. However, because there are no objective diagnostic criteria, it’s difficult. The ethanolamine phosphate (EAP) is newly presented as a major marker of it. The capillary electrophoresis time-of-flight mass spectrometry (CE-TOFMS) is used to measure serum EAP. However, simpler method is needed because it uses expensive instrument. From the above, we had aimed to make high sensitivity measuring method of EAP using enzymes. We developed an enzymatic assay using ortho-phosphoethanolamine phospho-lyase (PEAlyase). This enzyme acts on EAP to produce phosphoric acid, acetaldehyde, and ammonia. This enzymatic assay had reacted to phosphoric acid and got three molars of hydrogen peroxide from one molar of EAP. The endogenous substances in serum need to be eliminated first. We had used N-Ethyl-N-(2-hydroxy3-sulfopropyl)-3-methylaniline, sodium salt (TOOS) as coloring reagent. As results, the method had shown good linearity, however, the limit of detection and eliminating ability of phosphoric acid had been not enough. In order to solve these problem, we used Sodium-10- (carboxymethylaminocarbonyl)-3,7-bis(dimethylamino)phenothiazine(DA-67) as coloring reagent. METHODS: We examined the linearity, the eliminating ability of phosphoric acid, hypoxanthine, xanthine, and uric acid, and the limit of detection. All examinations were conducted with a Hitachi 7180 automated analyzer. RESULTS: Present method showed linearity to 35 µmol/L. The eliminating ability of phosphoric acid was improved (from 0.7 mmol/L to 2.0 mmol/L). The limit detection was also improved (from 1 µmol/L to 0.4 µmol/L). CONCLUSION: Since DA-67 has higher molar extinction coefficient, we could improve the limit of detection. The same reason also enabled us to reduce sample volume, resulting in improving elimination ability of phosphoric acid. However, these results are not enough because the EAP value of depression patients are lower than 1.5 µmol/L and the phosphoric acid value is easily gets higher in some diseases. In order to solve these problems, we are going to make ultra-high sensitivity detection system using metals and chelating color reagents. . |
| 33. |
Kouki Hosaka, Noriko Kawamitsu, Masaru Akimoto, Miyuki Sakemoto, Miki Kawano, Takiko Tateishi, Taeko Hotta, Dongchon Kang, Yuzo Kayamori, Eisaku Hokazono, A rapid and simple method to measure Tamm-Horsfall protein in the urine and to
investigate its clinical significance, World Congress of World Association of Societies of Pathology and Laboratory Medicine, 2017.11, Aim: Tamm-Horsfall protein (THP) was characterized by Tamm and Horsfall as an inhibitor of hemagglutination.
THP is the most abundant protein in human urine and the increase or decrease in the urinary excretion of THP is
an indicator of various clinical conditions and diseases, especially renal calculus. This protein readily
aggregates in response to various factors such as salt concentration and osmotic pressure in the urine. THP is
generally measured by an ELISA-based method. However, this method has limitations such as inaccuracy owing to
protein aggregation, and high cost of reagents. Therefore, we developed a rapid and simple method to measure
THP by using cost-effective reagents and studied the clinical significance of THP.
Method: THP was isolated from urine by salting out. For this, 15% ammonium sulfate, 72.5 mmol/L sodium
chloride, and 0.12% formic acid were added to 500 μL of urine sample. This mixture was centrifuged at 20,000 g
for 10 min. The supernatant was discarded, and the pellet was dissolved completely in 500 μL distilled water.
This protocol was repeated twice to completely isolate THP from the urine. Finally, THP in the sample solution
was detected at Ex/Em=280/325 nm with spectrofluorometer.
Result: The detection limit was 3 mg/L, and linearity was maintained in the range of 0-200 mg/L. The within-run
coefficient of variation (CV%) was 2.07% (mean±SD=79.1±1.64). THP recovery rates were good (95-106%).
Finally, the mean THP concentration in five healthy individuals was measured as 57.9 mg/L.
Conclusion: Our THP measurement method is rapid, simple, and cost effective. This simple protocol will enable
further research on THP. We intend to measure more clinical samples and study the clinical significance of THP
in future studies.. |
| 34. |
Shou Terada, Miyuki Sakemoto, Yukiko Kawanobe, Miki Kawano, Takiko Tateishi, Taeko Hotta, Dongchon Kang, Yuzo Kayamori, Eisaku Hokazono, Establishment and clinical utility of a rapid and simple assay for serum trehalase
activity, World Congress of World Association of Societies of Pathology and Laboratory Medicine, 2017.11, Background: Trehalase (TREH, trehalose 1-glucohydrolase, EC 3.2.1.28), which splits trehalose into two
glucose molecules, is found in the brush border membrane of human kidney, liver, and small intestine. Eze et
al. reported that plasma TREH activity is elevated in diabetic patients, although the mechanism for this is not
clear. Current TREH assays are sample- and time-intensive, and require cumbersome pretreatment. Thus, we aim to
establish a rapid, simple assay for serum TREH activity using an automated analyzer and examine its clinical
utility.
Methods: In this method, endogenous glucose is first removed by glucose oxidase (GOD) and catalase. Glucose
produced by TREH is then quantified by a coupled reaction with GOD and peroxidase. This reaction produces a
quinoneimine whose rate of formation is proportional to serum TREH activity and can be measured by absorbance
in a Hitachi 7600 automated analyzer. To examine the assay´s clinical utility, we measured the correlation
between serum TREH activity and each test item in 127 serum specimens submitted for biochemical and tumor marker
tests at Kyushu University Hospital.
Results: The assay was validated by measureing within-run CVs (<2.36%), between-day CVs (<3.41%), linearity (0-
100 U/L), detection limits (2 U/L), and recovery (100<±3%). Endogenous glucose (<200 mg/dL) could be
cleared, and ascorbic acid (<50 mg/dL) had no effect. Serum TREH activity was stable for <1 month at 25°C, <3
months at 4°C, <6 months at -80°C. Serum TREH activity (y) was weakly correlated with HbA1c (r = 0.444,
y=2.25x-1.63) and ChE (r = 0.521, y=0.039x+3.35).
Conclusions: Our assay for serum TREH activity is simple, rapid, and effective. The correlation with HbA1c and
ChE could be relevant for disease and should be examined further.. |
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保坂 洸喜, 川満 紀子, 秋本 卓, 酒本 美由紀, 河野 弥季, 立石 多貴子, 堀田 多恵子, 康 東天, 栢森 裕三, 外園 栄作, 尿中Tamm-Horsfall Protein の迅速・簡便な前処理法およびその測定法に関する基礎的検討, 第５７回日本臨床化学会年次学術集会, 2017.10, 【目的】Tamm-Horsfall Protein (THP)は1950年にウイルスの血球凝集反応を抑制する尿中タンパクとしてTammとHorsfallにより報告された。このタンパク質は，健常人尿中に最も多く排泄される糖タンパク質である。現在までにその尿中排泄量は様々な腎疾患との関連が示されており，近年では特に尿路結石症との関係が注目されている．THPは単分子量が約85－100 kDaであるが，尿中のNa+, Cl－などの塩類の濃度上昇や尿浸透圧，尿の酸性化などの因子により重合・凝集し易い特徴を持つ．現在，THPの測定法は主にELISAなどの免疫学的測定法で行われているため試薬が高価であり，また，操作が煩雑で測定に長時間を要する。さらに免疫学的測定法では，上記のTHPの重合・凝集の性質により抗原抗体反応が阻害され，特に低濃度域におけるTHPを正確に測定することは難しい．そこで本研究では，容易に入手可能な試薬である硫酸アンモニウム，塩化ナトリウムを用いて尿サンプルを前処理し，THPのみを分離するという安価で迅速・簡便なTHP測定法の確立を目指し検討を行ったので報告する．
【原理】塩析によりTHPのみを分離する．尿サンプルに硫酸アンモニウム，塩化ナトリウムを加えることでTHPを凝集，沈殿させ，上清を捨てる．残ったTHPの沈殿を精製水に溶解させる．この洗い操作を２回繰り返し，分離したTHPを蛍光検出によって定量する．
【方法】本測定系の測定試薬および測定条件は以下のとおりである．
前処理試薬：15％硫酸アンモニウム，72.5 mmol/L 塩化ナトリウム
尿サンプル500 µLに前処理試薬500 µLを加え，10分混和後，20,000 gで10分遠心．上清を除去した後に500 µLの精製水を添加．完全にTHPを溶解させ，同様の操作をもう１度繰り返す．最後に沈殿となったTHPをTSEバッファー（10 mmol/L Tris, 1 mmol/L EDTA, 1% (w/v) SDS, pH 8.8）にて完全に溶解させEx/Em＝280/325 nmで検出．
【結果】1)再現性，直線性：Mean±SD=40.4±0.95 mg/Lの尿サンプルにおける同時再現性(n=10)は，CV=3%以下であった．また100 mg/Lまでの原点を通る直線を確認した．2)検出感度：THP標準物質を用いた±2 SD法による最小検出感度は，3 mg/Lであった．3)添加回収試験：添加回収率は95-105％と良好な回収率を示した．4)THP以外の尿中タンパクの影響：50 mg/L THP標準液に精製水および50 mg/LのALB,αβGLB, γGLB をそれぞれ添加した4種類のタンパク溶液を用いて本法に及ぼす影響を検討した結果，それぞれ－1.5%, 1.6%, 10.4%の誤差を認めた．
【結論】本測定法は，塩析の原理を用いた非常に安価で簡便なTHPの分離・測定法であり，従来問題とされていた測定時間の長さや試薬のコストなどを大幅に改善することができた．今後は実検体を用いて，高速液体クロマトグラフィー法との相関の有無や腎疾患における臨床的意義の検討を行っていく．
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寺田 祥, 酒本 美由紀, 川述 由紀子, 河野 弥季, 立石 多貴子, 堀田 多恵子, 康 東天, 栢森 裕三, 外園 栄作, 尿中トレハラーゼ活性測定法の確立とその臨床的有用性に関する研究, 第５７回日本臨床化学会年次学術集会, 2017.10, 【目的】トレハラーゼ(Trehalase，以下TREHと略)とは，二糖類トレハロースを二分子のグルコースに加水分解する酵素である．ヒト体内では小腸や肝臓，腎臓の刷子縁膜において高いTREH活性を認めるとする報告があり，その具体的な生理学的な役割については不明な点が多い．中野らは，ヒト尿中にTREH活性を見出し，腎尿細管障害の指標になる得ることを報告している．また糖尿病や妊娠高血圧症候群など，疾患との関連性も指摘されている．尿中TREH活性の測定法に関する報告はこれまでにもいくつかあるが，測定に長時間を要する上に，透析や限外濾過による前処理が必要なため非常に煩雑なものばかりであった．また前処理によって変動する値の補正方法が明記されておらず，定量性に疑念が残る．そこで本研究では，前処理不要でかつ定量性の優れた尿中TREH活性測定法の構築を目指し，さらに臨床的な意義を探索することで，生体内に存在しながらも追究されることの少なかったTREH活性の新たな疾患マーカーとして可能性を見出すことを目的とする．
【方法】試料中に存在する内因性のグルコースを分解・消去するために，まずヘキソキナーゼ(HK)によってグルコースをすべてグルコース6リン酸に変化させ，グルコースデヒドロゲナーゼ(GDH)の基質とならない分子構造にする(第一次反応)．この後，HKの活性発現に必須なMg2+をエチレンジアミン四酢酸(EDTA)でキレートすることでHK活性を阻害する．そして，基質トレハロースを添加し，試料中のTREH活性によって生じた二分子のグルコースに，β-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸酸化型(β-NADP＋)の存在下でGDHを作用させるとD-グルコノ-δ-ラクトンを生成する．このとき，β-NADP＋が還元されて生成されたβ-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型(β-NADPH)の増加量を340 nmで比色定量する(第二次反応)．分析装置には日立U-2810形分光光度計(日立ハイテクノロジーズ(株))を用い，検体(180 µL)と第一試薬(180 µL)を混合し37℃，20分間反応後，第二試薬(540 µL)を添加し，37℃，1時間反応後の吸光度変化量を340 nmで測定．
【成績】同時再現性は高濃度域(10 U/L)で変動係数0.44%，低濃度域(1 U/L)で変動係数4.7%となった．また，直線性は10 U/Lまで確認でき，尿試料を用いた添加回収試験の回収率は129%となった．
【結論】従来法より迅速・簡便で，かつ定量性の優れたTREH活性測定法を構築できた．今後は，検体に実試料となる尿検体を用いてより実用的な測定法の構築を検討するとともに，尿中TREH活性の臨床的有用性について示していきたい．
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外園 栄作, 大澤 進, 福谷 優理, 川元 ゆかり, 河野 弥季, 立石 多貴子, 酒本 美由紀, 堀田 多恵子, 康 東天, 栢森 裕三, Chromeazurol B（CAB)を用いた尿中総蛋白測定法の汎用自動分析装置への応用
, 日本臨床検査自動化学会, 2017.09, 各種腎・尿路系疾患において，尿中総蛋白を定量する事は，その病態や治療の効果などを把握することが可能となり，臨床上その意義は大きい。現在，尿中総蛋白測定法としてﾋﾟﾛｶﾞﾛｰﾙﾚｯﾄﾞ・ﾓﾘﾌﾞﾃﾞﾝ錯体法が広く用いられているが，低分子蛋白との反応性が低いなどの問題を有している。
そこで我々は，低分子蛋白を高感度に検出できる測定法を目指し，銅とﾌｪﾆﾙﾒﾀﾝ系色素であるｸﾛﾑｱｽﾞﾛｰﾙB（CAB）を用いた新しい測定試薬の開発を行ってきた。これまでの検討で，本法が再現性，最小検出感度など，臨床検体を測る上で十分な定量特性を有していることを確認したが，試薬開栓後の安定性において問題があることが分かった。そこで，今回は開栓後の試薬安定性の改善について検討を行ったので報告する。
【測定原理】
ｱﾙｶﾘ条件下で銅と蛋白を結合させた後，銅に特異的に結合するCABを加え，蛋白-銅-CABの三次元複合体を形成させ，その複合体の吸光度を測定し蛋白濃度を算出する。
【測定機器および分析条件】
測定機器：日立7180形自動分析装置（日立ﾊｲﾃｸﾉﾛｼﾞｰｽﾞ（株）） 分析条件：試料2 uLと第1試薬（R1）140 uLを混和，5分間反応後，第2試薬（R2）70 uLを加え5分間反応後，主波長660 nm，副波長800 nmで 2ﾎﾟｲﾝﾄｴﾝﾄﾞ法で測定。
【結果】
緩衝液の塩濃度とpHについて再検討をおこない，作製したR1，R2を分析装置内の保冷庫に開栓した状態で保管し，初日のみ校正を行い28日間の試薬安定性について検討を行った。結果，改良前の試薬において開栓後28日目で測定値が40％上昇したのに対して，改良後の試薬ではその上昇は測定値の変動幅の6.6％であった。
【まとめ】
臨床検体を測定する上でその試薬の安定性は，信頼あるﾃﾞｰﾀを臨床に返す上で非常に重要である。今回，試薬の改良により，開栓後の試薬安定性を大きく向上することができ，本法は日常検査に十分に耐えうる測定試薬になったといえる。
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Eisaku Hokazono, Susumu Osawa, Eri Ohta, Miki Kawano, Takiko Tateishi, Masanori Seimiya, Yuzo Kayamori, Preliminary study on a high-sensitivity hydrogen peroxide detection method using the metal chelating reagent, Chromazurol B (CAB), American Association for Clinical Chemistry, 2017.08, Background:
Quantitation of biological sample components and enzyme activities is indispensable for determining the pathological condition of patients. The rapid determination and return of accurate results is critical to clinical chemical analysis for clinical diagnosis. The sensitivity of analytical techniques is vital to ensuring the accuracy of analyses.
Currently, two detection techniques are used for the majority of clinical enzyme activity measurements. The first of these methods, NAD (P) H, has low sensitivity, but is largely unaffected by reducing compounds. Conversely, the hydrogen peroxide-peroxidase method is highly sensitive, but is adversely affected by the presence of reducing species; especially when measuring urinary constituents.
Therefore, in the present study, we developed a novel high-sensitivity measurement system for hydrogen peroxide (H2O2) using a metal chelating reagent, Chromazurol B (CAB).
Methods:
CAB develops an absorption band at 600 nm when chelating Fe3+. In our novel method, Fe2+ is oxidized to Fe3+ by hydrogen peroxide originating from oxidizing enzymes under acidic conditions. Then, the absorbance of the CAB-Fe3+ complex is measured at 600 nm, and the increase in absorbance can be used to determine the quantity of hydrogen peroxide.
In this study, we used a Hitachi Model 7170 and 7600 (P module) automated analyzer to perform a two-point end assay at 37°C. The sample (H2O2, 10 µL) was mixed with 200 µL of reagent 1 (117 µmol/L iron (Ⅱ) sulfate and 0.12 mol/L formic acid buffer (pH 4.0, 25°C)). The mixture was maintained at 37°C for 5 min. After the addition of 24 µL of reagent 2 (975 µmol/L CAB in distilled water), the absorbance was measured at 600/800 (main/sub) nm wavelengths.
Results:
The within-run CVs of the above method using 0.4 and 2.2 µmol/L H2O2 solutions were 3.78 and 1.74%, respectively (n = 20). The results exhibited linearity from 0 to 3.0 µmol/L. The detection limit was 0.2 µmol/L. The molar absorption coefficient, indicating the measurement sensitivity, was 202,160 L·mol−1·cm−1. This is about seven times or over greater than the sensitivity of the current methods.
Conclusion:
The newly-developed method was highly sensitive to hydrogen peroxide, and may be applicable in a wide range of research and clinical laboratories. In the future, we will investigate the effects of reducing substances in biological samples, such as serum and urine, on the sensitivity of this method.. |
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寺田 祥, 酒本 美由紀, 川述 由希子, 河野 弥季, 立石 多貴子, 堀田 多恵子, 康 東天, 栢森 裕三, 外園 栄作, 迅速・簡便な血清Trehalase活性測定法の確立とその臨床的有用性に関する研究, 日本臨床検査医学会 九州地方会, 2017.03. |
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寺田 祥, 太田 英里, 河野 弥季, 立石 多貴子, 栢森 裕三, 外園 栄作, 迅速・簡便な血清Trehalase活性測定法の確立とその臨床的有用性に関する研究, 日本臨床化学会, 2016.12, 【目的】
Trehalase(以下、TREHと略)とは，二糖類Trehaloseを二分子のGlucose (以下、Gluと略)に加水分解する酵素である．ヒト体内では小腸や肝臓，腎臓の刷子縁膜において高いTREH活性を認めるとする報告1),2)があり，その具体的な生理学的な役割については不明な点が多い．与芝ら2)は，血清中にTREH活性を見出し，肝胆道系疾患で上昇し，さらに胆汁鬱滞患者において高度に上昇することを報告している．また，γ-GT と相関が認められたことから，「胆管酵素」としての臨床的意義を持つ可能性についても言及している．さらに，L.C.Ezeら3)は，原因・機序は明らかではないが糖尿病患者においてTREH活性が上昇することを報告している．測定法はこれまでいくつか報告されているが，検体量が多く，測定に長時間を要するなど，いずれも煩雑なものばかりである．そこで本研究では自動分析装置を用いて，迅速かつ簡便に一度に多数の検体が測定可能なTREH活性測定法を構築し，さらに臨床的な意義を探索することで，生体内に存在しながらも追究されることの少なかったTREH活性の新たな疾患マーカーとして可能性を見出すことを目的とする．
【方法】
試料中に存在する内因性のGluを分解・消去するために，第一試薬でまずMutarotaseによってα- Gluをすべてβ- Gluに変換する．その後，Glucose oxidaseによって内因性Gluを分解・消去する．その際に発生したH2O2は第二試薬における活性測定において正誤差を引き起こすため，Catalaseで分解除去する．第二試薬では，基質であるTrehalose存在下で，試料中の酵素TREHにより二分子のα- Gluを生成させた後，第一試薬と同様の方法でH2O2を発生させ，peroxidase存在下で，4-AA，TOOSとを酸化縮合発色させ，546 nmにおける1分間あたりの吸光度変化量をTREH活性として比色定量する．分析装置には日立7600形自動分析装置を用い，検体 (15 µL) と第一試薬 (180 µL) を撹拌混合し37℃, 1.5分間反応後，反応溶液を撹拌させ，さらに3.5分間反応後，第二試薬 (105 µL) を添加．その後23-30ポイントにおける1分間当たりの吸光度変化量をレート法にて，主波長546 nm，副波長800 nmで測定．
【成績】
基礎的性能評価（同時再現性，日差再現性，添加回収試験，直線性，最小検出感度）は良好な結果となった．また，内因性Gluは200 mg/dLまで消去可能であり，アスコルビン酸は50 mg/dLまで測定値に影響がないことを確認した．9.5 mg/dL遊離型ビリルビンで9％，10.7 mg/dL抱合型ビリルビンで10％，225 mg/dL溶血ヘモグロビンで6％の負誤差を生じた．血清TREH活性は室温，冷蔵，冷凍のいずれの保存条件でも4週間は安定であった．
【結論】
本法は，迅速かつ簡便に血清TREH活性を測定するのに十分な基礎的性能を有しているといえる．今後はさらに実試料での検討を進め，血清TREH活性の基準範囲や臨床的有用性について検討をすすめる．
（文献）
1) 中野昌俊: 哺乳動物における小腸および腎臓の刷子縁膜トレハラーゼ.
膜 (MEMBRANE) 11(6): 326-333, 1986
2) 与芝真, 岡田吉博, 鈴木宏ほか: 血中トレハラーゼ活性の臨床的意義.
肝臓 23(4): 449, 1982
3) L.C.Eze, D.A.Price Evans: PLASMA TREHALASE ACTIVITY IN DIABETES
MELLITUS. CLINICA CHIMICA ACTA 28: 153-159, 1969
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中野 由依, 外園 栄作, 太田 英里, 河野 弥季, 立石 多貴子, 大澤 進, 栢森 裕三, 糖負荷試験残余検体を用いた胃粘膜傷害試験としてのMaltoseの酵素的測定法とUHPLC法の開発, 日本臨床化学会, 2016.12, 【目的】胃癌は遠隔に転移した場合，5年生存率が著しく低下することから早期に発見し治療を行うことが重要である．そのため患者への負担が少なく早期発見が可能である安価なスクリーニング検査法が求められている．胃粘膜傷害部位からSucroseが直接透過・吸収され血中に移行することを利用した簡便な胃粘膜傷害検査法が開発・報告されているが，経口投与のためのSucrose溶液を特別に用意する必要がある．糖負荷試験に用いられる経口摂取糖液（トレーランG）内には二糖類のMaltoseが含まれている．そこで，Sucroseの代わりにMaltoseを利用し，糖負荷試験残余検体を用いた胃粘膜傷害を検出するためのMaltose酵素的測定法の開発を目的としている．さらに酵素法とのリファレンス法としてMaltose分析のためのUHPLC法を開発し，酵素的測定法の評価を行う．
【方法】＜酵素的測定法＞第一試薬中で内因性Glucoseを消去，その後第二試薬中のα-GlucosidaseでMaltoseを分解し，Glucose oxidaseによって生じた過酸化水素をperoxidaseの存在下で4-Aminoantipyrine，TOOSと反応させ546 nmで測定する．装置には日立7600形自動分析装置を用い，2-ポイント-エンドアッセイにて測定を行った．＜UHPLC法＞Maltoseのピークに影響を与える他の糖（Glucose，Galactose，Lactose）を酵素処理によって消去し，除タンパク後濃縮を行う．その後4-(3-Methyl-5-oxo-2-pyrazolin-1-yl)Benzoic Acid(PMPA)を用いラベル化を行いUV検出器で検出する．UHPLC法は，日立超高速液体クロマトグラフLaChrom Ultra システム（L-2160U形ポンプ，L-2200形オートサンプラ，L-2300形カラムオーブン，L-2455形DAD検出器）を使用した．カラム；Hitach LaChromUltra C18 50×2.0 mm l.D，溶離液；アセトニトリルと40 mmol/L酢酸/酢酸Na緩衝液（pH 4.2），流速；0.3 mL/min，カラム温度；50℃，UV検出；271 nm．注入量；5 µL．
【成績】＜酵素的測定法＞基礎的性能評価（同時再現性，添加回収試験，直線性，最小検出感度）は良好な結果となった．＜UHPLC法＞Maltoseの溶出時間は3.7 分となった．本方法では血漿中の他の物質の影響を受けずにMaltoseを測定できることが分かった．2法の相関関係も良好であり，トレーランGによる糖負荷試験の前後で健常者血中のMaltoseが上昇することが分かった．
【考察】酵素的測定法は糖負荷試験前後の血漿Maltoseを観察するための十分な感度を有している．MaltoseはSucroseと同様に胃粘膜傷害検査法として利用できる可能性がある．今後は臨床検体を用い，胃粘膜傷害の程度と血漿Maltoseの上昇率の検討からMaltoseの臨床的有用性について検討していきたい．
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Eisaku Hokazono, Yuri Fukuya, Eri Ohta, Yukari Kawamoto, Takiko Tateishi, Miki Kawano, Susumu Osawa, Yuzo Kayamori, Development of the high-sensitivity assay of protein by new principle of three-dimensional complex with protein-copper-Chromazurol B, Asia-Pacific Federation for Clinical Biochemistry, 2016.11, Urine protein measurement has been used for the diagnosis and monitoring of renal disease for many years. In the laboratory, various methods have been used to measure it: Sulfosalicylic acid, Coomassie brilliant blue, Pyrogallol red-molybdate (PR-Mo) and so on. But these methods have different reactivity for each component protein in urine and body fluid.
We applied the copper (Cu)-chelating ligand, Chromazurol B (CAB) to the assay of urine protein based on Biuret reaction in natural pH. The present method used a Hitachi Model 7180 automation analyzer. The assay was performed with a two-point end assay at 37ºC. The calibrator or urine (2 µL) was mixed with 160 µL reagent 1 (4.75 mmol/L Cu and 15 mmol/L potassium sodium tartrate, 0.005% anion surfactant in alkaline buffer), then kept for 5 min at 37ºC. After addition of 80 µL reagent 2 (1.78 mmol/L CAB, 0.36 mmol/L chelating agent in neutral buffer), the absorbance was measured at 660/800 (main/sub) nm wavelength. The PR-Mo method (already commercially available) was performed for comparison. The procedure was performed with designated measurement parameters and the conventional calibrator of manufacturers.
The within-run CVs of the present method with human serum albumin (HSA) solution (100 and 1000 mg/L) were 4.35% and 0.88%, respectively (n=20). The present method showed linearity from 0 to 3000 mg/L. Each response with α, β-globulin and γ-globulin was 94% and 100%, respectively, based on the reaction for albumin. With regard to the correlation with PR-Mo method (x) and our present method (y), the linear regression formula was y = 1.24 x – 3.13, the correlation coefficient was 0.915 (n=30).
We consider this method can be adapted for not urine samples but also other body fluids (ex. puncture fluid) in a clinical laboratory, because it gives almost the same performance for main proteins, and it also has stabilities and accuracies.
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Eri Ohta, Eisaku Hokazono, Takiko Tateishi, Miki Kawano, Susumu Osawa, Yuzo Kayamori, Development of an enzymatic method for ethanol amine in blood, Asia-Pacific Federation for Clinical Biochemistry, 2016.11, Ethanolamine (EA) is mainly hydrolyzed from phosphatidyl ethanolamine (PE) by phospholipase D (PLD) in vivo. A study repotted that urine EA increased in newborn as Zellweger syndrome that is a congenital metabolic diseased. In recently, a metabolomics study using mass spectrometory reported that EA in saliva of pancreatic cancer patients increased significantly. The blood concentration of EA in healthy volunteer is 11.84 ± 4.15 µmol/L, but its clinical significant in adult were not clarify. Therefore, our purposes are to develop a rapid and simple enzymatic method for EA in blood with an amine oxidase involving cupper from Arthrobacter sp. (AAO) (EC 1.4.3.6) and to examine the clinical meaning of EA in plasma. In our measurement method, regent 1 (R-1) was contained of 0.1 mol/L HEPES buffer (pH 8.0 at 25ºC), 1.5 mmol/L TOOS, 5.0 kU/L POD, 10.0 kU/L L-ascorbate oxidase (ASOD), and regent 2 (R-2) was contained of 0.1 mol/L HEPES buffer (pH 8.0 at 25ºC), 15.0 kU/L AAO, 0.3 mmol/L 4-aminoantipyrine, 90.0 µmol/L potassium ferrocyanide. The assay used a Hitachi 7600 type analyzer. A 30 µL specimen was mixed with 180 µL R-1; after incubation for 5 min at 37 ºC, 90 µL R-2 was added; after another 5 min, the mixture was measured using a 2-point end assay performed at 37 ºC, with wavelengths of 800/546 (sub/main wavelength). The within-run CVs of the present method with kinds of EA solutions were % (n=10). The standard curve showed the linearity from 0 to 100 µmol/L. Analytical recovery was 89.5%. We succeeded in the development of a new enzymatic assay for EA in blood. And our present method will facilitate further research on the physiologic role of EA.
The present method is comprised of two reagents: one is for making β-glucose-1-phosphate by maltose phosphorylase and in the other, measuring NADPH produced by β-phosphoglucomutase and glucose-6-phosphate dehydrogenase. The enzymatic assay is used with a Hitachi 7600 automated analyzer. Plasma maltose was measured based on a 2-point end assay.
The average within-run CVs with maltose solutions (10 and 30 μmol/L) were 3.6% and 2.2%, respectively (n=10), while the recovery test was 95%. We consider that maltose has a potential that is available as a test of damaged gastric mucosal instead of sucrose. We address the relationship between the severity of gastric mucosa disorder and the maltose concentration. Method: < Enzymatic method > This method is comprised of two reagents: one is for removal of endogenous glucose by GOD and in the other α-Glucosidase acts for maltose and the formed glucose is detected. The enzymatic assay is used with a Hitachi 7600 automated analyzer. Plasma maltose was measured based on a 2-point end assay. The following conditions were used. Column; GL InertSustain C18 50×2.0 mm l.D. Eluent; acetonitrile and 40 mmol/L acetic acid/sodium acetate buffer (pH 4.2). Flow rate; 0.3 mL/min. Column temperature; 50ºC. UV detect; at 271 nm. Injection volume; 5 µL. Result: Basic performance evaluations (within-run CVs, recovery test, linearity and detection limits) were good. Maltose was retained at 3.7 min. The present method was sufficient to detect maltose without interference from other components in plasma. The correlation of the two methods is also good. Conclusions: Our enzymatic assay was sensitive enough to monitor plasma maltose concentrations during an oligosaccharide permeability test. We consider Maltose has a potential that is available as the test of damaged gastric mucosal instead of sucrose. We address the relationship between the degree of gastric mucosa disorder and maltose concentration.. |
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Yoko Hashida, Akari Umemura, Eisaku Hokazono, Eri Ohta, Takiko Tateishi, Miki Kawano, Susumu Osawa, Yuzo Kayamori, Development of an enzymatic method with maltose phosphorylase for maltose permeability test of gastric mucosa using oral glucose tolerance samples
, Asia-Pacific Federation for Clinical Biochemistry, 2016.11, The examination of gastric mucosal damage is performed by a gastrointestinal test contrasting with X-rays and pepsinogen test in serum. Additionally, sucrose permeability has been suggested as a simple and noninvasive marker of gastric mucosal damage in human subjects. Our objective was to develop a maltose permeability test of gastric mucosa using oral glucose tolerance samples instead of sucrose. We earlier reported a method for maltose measurement using α-glucosidase, but this method had some problems including low specificity to substrate and the necessity to erase endogenous glucose in plasma. Therefore, we aim to develop an enzymatic method using maltose phosphorylase to measure maltose directly and specifically.
The present method is comprised of two reagents: one is for making β-glucose-1-phosphate by maltose phosphorylase and in the other, measuring NADPH produced by β-phosphoglucomutase and glucose-6-phosphate dehydrogenase. The enzymatic assay is used with a Hitachi 7600 automated analyzer. Plasma maltose was measured based on a 2-point end assay.
The average within-run CVs with maltose solutions (10 and 30 μmol/L) were 3.6% and 2.2%, respectively (n=10), while the recovery test was 95%. We consider that maltose has a potential that is available as a test of damaged gastric mucosal instead of sucrose. We address the relationship between the severity of gastric mucosa disorder and the maltose concentration. Method: < Enzymatic method > This method is comprised of two reagents: one is for removal of endogenous glucose by GOD and in the other α-Glucosidase acts for maltose and the formed glucose is detected. The enzymatic assay is used with a Hitachi 7600 automated analyzer. Plasma maltose was measured based on a 2-point end assay. The following conditions were used. Column; GL InertSustain C18 50×2.0 mm l.D. Eluent; acetonitrile and 40 mmol/L acetic acid/sodium acetate buffer (pH 4.2). Flow rate; 0.3 mL/min. Column temperature; 50ºC. UV detect; at 271 nm. Injection volume; 5 µL. Result: Basic performance evaluations (within-run CVs, recovery test, linearity and detection limits) were good. Maltose was retained at 3.7 min. The present method was sufficient to detect maltose without interference from other components in plasma. The correlation of the two methods is also good. Conclusions: Our enzymatic assay was sensitive enough to monitor plasma maltose concentrations during an oligosaccharide permeability test. We consider Maltose has a potential that is available as the test of damaged gastric mucosal instead of sucrose. We address the relationship between the degree of gastric mucosa disorder and maltose concentration.. |
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橋田 葉子, 梅村 明, 太田 英里, 立石 多貴子, 河野 弥季, 大澤 進, 栢森 裕三, 外園 栄作, Maltose phosphorylaseを用いた血中マルトース測定法の検討, 日本臨床検査自動化学会, 2016.09, 日本の胃癌の罹患率および死亡数は共に高く, 早期発見・早期治療が非常に重要である. そのため患者への身体的・経済的な負担が少なく，かつ簡便で早期発見が可能なスクリーニング検査の開発が求められる．これまで当研究室では，Maltoseが胃粘膜障害部位から吸収されることを利用した胃粘膜障害検査法の構築を試み，α-glucosidase (α-Gl)を用いた血中Maltose測定法の開発・報告を行った．しかし, これまで構築した測定法は試薬の安定性に問題があった．また， Maltoseを２分子のGlucoseに変換し測定するため，内因性のGlucoseを予め消去する必要性と，α-Glの基質特異性の低さの問題点が課題であった．そこで今回は，Maltoseへの基質特異性が高いMaltose phosphorylase (MP)に着目し，さらに内因性Glucoseの消去が不要な測定系の構築を目指し検討を行ったので報告する．【原理】 MPの存在下, Maltoseから1分子のGlucose-1-phosphate (G-1-P)を生成し, β-phosphoglucomutase (β-PGM)によりG-1-PをGlucose-6-phosphateに変換する. Glucose-6-phosphate dehydrogenase(G6PDH)の存在下, NADPHを生成し定量する．【方法】 第一試薬(R-1)；リン酸緩衝液（pH 7.0），MP，G6PDH，α-グルコース-1,6-ビスリン酸．第二試薬(R-2)；リン酸緩衝液（pH 7.0），β-PGM，β-NADP+，MgCl2． 分析装置：日立7600形自動分析装置（日立ハイテクノロジーズ（株））；分析条件：検体(30 µL)とR-1(120 µL)を混合し37℃で5分間加温静置後R-2(90 µL)を添加し37℃で5分間加温静置後に測定；校正：30 µmol/L Maltose溶液を用いて波長(副/主)= 800/340 nm にて2ポイントエンド法にて校正後測定．【結果・考察】 直線性，同時再現性，添加回収試験などの基礎的性能評価はいずれも良好であった．しかし，最小検出感度は4.0 µmol/Lとなり，健常者検体のマルトース濃度を考えるとより高感度な測定系の構築が求められる．. |
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Yui Nakano, Eisaku Hokazono, Eri Ohta, Miki Kawano, Takiko Tateishi, Susumu Osawa, Yuzo Kayamori, Examinationofthemaltosedetectionmethodastheexaminationofgastricmucosa disorder
-Development of the enzymatic method and UHPLC method for maltose permeability test of gastric mucosa using oral glucose tolerance samples-, International Federation of Biomedical Laboratory Science, 2016.09, Background: Early detection and treatment of gastric cancer are important. An easily and noninvasive screening test is required for detection in the early stage of gastric cancer. Seimiya et al. reported the sucrose permeability test as a simple and noninvasive marker of gastric mucosal damage in human subjects. Therefore, we aim to develop an enzymatic method for a maltose permeability test of gastric mucosa using oral glucose tolerance samples instead of sucrose. Moreover, we developed an Ultra High-Performance Liquid Chromatography (UHPLC) method for measuring maltose as a reference method and estimated the present enzymatic method with it.
Method: < Enzymatic method > This method is comprised of two reagents: one is for removal of endogenous glucose by GOD and in the other α-Glucosidase acts for maltose and the formed glucose is detected. The enzymatic assay is used with a Hitachi 7600 automated analyzer. Plasma maltose was measured based on a 2-point end assay. The following conditions were used. Column; GL InertSustain C18 50×2.0 mm l.D. Eluent; acetonitrile and 40 mmol/L acetic acid/sodium acetate buffer (pH 4.2). Flow rate; 0.3 mL/min. Column temperature; 50ºC. UV detect; at 271 nm. Injection volume; 5 µL.
Result: Basic performance evaluations (within-run CVs, recovery test, linearity and detection limits) were good. Maltose was retained at 3.7 min. The present method was sufficient to detect maltose without interference from other components in plasma. The correlation of the two methods is also good.
Conclusions: Our enzymatic assay was sensitive enough to monitor plasma maltose concentrations during an oligosaccharide permeability test. We consider Maltose has a potential that is available as the test of damaged gastric mucosal instead of sucrose. We address the relationship between the degree of gastric mucosa disorder and maltose concentration.. |
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Kouki Hosaka, Miki Kawano, Eri Ohta, Takiko Tateishi, Yuzo Kayamori, Eisaku Hokazono, Examination of purification of Tamm-Horsfall Protein in urine ーImprovement of recovered amount and working efficiency in purification of Tamm-Horsfall Protein in urineー, International Federation of Biomedical Laboratory Science, 2016.09, Aim: Tamm-Horsfall Protein (THP) is synthesized in the thick ascending limb of the loop of Henle and is the most abundant protein in human urine. The increase and decrease of the quantity of this urinary excretion are related to the various clinical conditions and the course of disease, especially renal calculus. This protein has the characteristic that is easy to aggregate by various factors (salt concentration, osmotic pressure in urine etc.). This brings about some problems in purification for measuring THP, especially enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)-based methods. Therefore, we aimed to establish an efficient protocol for purification of THP in urine for a standard, which is used on analyzing THP.
Method: We tried to arrange the method with the diatomaceous earth filtration by Franca et al. to purify from pooled urine of healthy volunteers. We evaluated our present method with imitated urine as the purity and quantity of separation (The evaluation of purity used sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and THP concentration was measured by absorbance in 277 nm.).
Results: Compared with the conventional method, our method was able to obtain 1.4 times the amount of THP. And the purified component did not include most proteins in urine except THP. In addition, the present method was able to shorten the operation time.
Conclusion: The present method can purify more THP in urine more easily in a shorter time. Not only are more problems avoided in THP measurement, but also our simple protocol will facilitate further research on the physiologic role of THP.. |
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福谷 優理, 川元 ゆかり, 太田 英里, 外園 栄作, 大澤 進, 栢森 裕三, Chromeazurol B(CAB）を用いた高感度尿中総蛋白測定法の汎用自動分析装置への適用, 生物試料分析科学会, 2016.02. |
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中野 由依, 太田 英里, 河野 弥季, 立石 多貴子, 外園 栄作, 大澤 進, 栢森 裕三, UHPLCを用いた血中Maltoseの測定法の開発, 生物試料分析科学会, 2016.02. |
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太田 英里, 梅村 明, 中野 由依, 河野 弥季, 立石 多貴子, 外園 栄作, 大澤 進, 栢森 裕三, 糖負荷残余検体を用いた胃粘膜障害検査法の開発（第３報）, 生物試料分析科学会, 2016.02. |
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垰田 直美, 篠原 克幸, 外園 栄作, 大澤 進, 日本電子BM9130による過ヨウ素酸ナトリウムを用いたICG自動分析法, 生物試料分析科学会, 2016.02. |
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外園 栄作, 河野 弥季, 太田 英里, 秋本 卓, 立石 多貴子, 林 江梨香, 大澤 進, 栢森 裕三, 生体試料中の還元物質の影響を受けづらい高感度検出技術の開発, 生物試料分析科学会, 2015.02. |
| 53. |
秋本 卓, 立石 多貴子, 太田 英里, 外園 栄作, 栢森 裕三, 逆相クロマトグラフィーによる尿中Tamm-Horsfall Protein(THP)測定法の開発, 日本臨床検査医学会, 2014.11. |
| 54. |
太田 英里, 外園 栄作, 秋本 卓, 立石 多貴子, 栢森 裕三, 血清Ethanolamine の酵素的測定法の開発とその臨床的意義の検討, 日本臨床検査医学会, 2014.11. |
| 55. |
外園 栄作, 太田 英里, 大澤 進, 川元 ゆかり, 秋本 卓, 立石 多貴子, 栢森 裕三, Chromazurol B(CAB)を用いた高感度尿中総蛋白測定法の改良とその基礎的性能評価, 日本臨床検査医学会, 2014.11. |
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太田 英里, 外園 栄作, 秋本 卓, 立石 多貴子, 栢森 裕三, 血清Ethanolamine の酵素的測定法の開発, 日本臨床検査自動化学会, 2014.10, 始めに
エタノールアミン(EA)は生体内においてホスホリパーゼDの加水分解作用によって，ホスファチジルエタノールアミン(PE)から主に生成される．今日のメタボロミクス研究によると，膵癌患者の唾液中でEAが有意に上昇するとの報告があった．また，ラットにおいて，肝細胞が増殖する際に血中のEAが上昇すると報告があったが，ヒトの成人における血中EAの臨床的意義はまだ明らかになってはいない．
EAは薄層クロマトグラフィー法やガスクロマトグラフィー・質量分析計(GC-MS)，あるいはキャピラリー電気泳動・質量分析計(CE-MS)で測定されており，コストが高いことや操作が煩雑で時間がかかるといった欠点がある．そこで，本法ではArthrobacter sp.由来銅含有アミンオキシダーゼ(AAO) (EC 1.4.3.6)を用いた迅速かつ簡便な血清EA酵素的測定法の開発を試みた．
方法
1. 発色試薬の検討：本法では，ペルオキシダーゼ(POD)の存在下でAAOにより生成されたH2O2を酸化縮合反応させた．そのときに使用する発色試薬は，より長波長側で測定するために(1)DAOS・4-アミノアンチピリン(4-AA)，(2)DA-67，(3)MCDPから選択した．
2. 操作法：試料 30 μLに第一試薬を180 μL加え，37˚Cで5分加温後，AAOの入った第二試薬を混和し呈色反応の後，主波長600 nm (DAOS・4-AA)および660 nm (DA-67，MCDP)，副波長800 nmで2ポイントエンド法にて測定を行った．測定機器は日立7600形自動分析装置を用いた．
結果・考察
本法における発色試薬はDA-67を用いた時が最もモル吸光係数が高く，高感度に測定可能であることがわかった．また，DA-67を用いて添加回収試験を行ったところ，10 μmol/L添加血清で前希釈機構を用いて回収率が94.5%となり，良好な結果を得られた．今後は試薬の保存安定性や，高速液体クロマトグラフィー法との相関の有無を検討し，本法を用いて検体を測定していく．
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外園 栄作, 太田 英里, 秋本 卓, 立石 多貴子, 栢森 裕三, 川元 ゆかり, 大澤 進, Chromazurol Bを用いた新しい測定原理による高感度尿中総蛋白測定法の開発, 日本臨床化学会, 2014.09. |
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Eisaku Hokazono, E. Ota, S. Osawa, S. Kiuchi, M. Akimoto, T. Tateishi, Yuzo Kayamori, Development of the high sensitive assay of protein by new principle of three-dimensional complex with protein-cupper-Chromazurol B, IFCC WORLDLAB ISTANBUL , 2014.06, BACKGROUND
Urine protein measurement has been used for the diagnosis and monitoring of renal disease for many years. In the laboratory, various methods have been used to measure it: Sulfosalicylic acid method, Coomassie brilliant blue method, Pyrogallol red-molybdate method (PR-Mo) and so on. But their methods have different reactivity for each component protein in urine and body fluid.
METHODS
We applied the copper (Cu)-chelating ligand, Chromazurol B (CAB) to the assay of urine protein based on Biuret reaction in natural pH. The present measurement method used a Hitachi Model 7170 automation analyzer. The assay was performed with a one-point end assay at 37ºC. The calibrator or urine (3 µL) was mixed with 35 µL reagent 1 (R-1: 0.1 mol/L NaOH solution containing 12 mmol/L Cu and 50 mmol/L potassium sodium tartrate), then kept for 5 min at 37ºC. After addition of 175 µL reagent 2 (R-2: pH 5.3, 0.1 mol/L 2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl] ethanesulfonic acid (HEPES) solution containing 0.5 mmol/L CAB), the absorbance was measured at 600/800 (main/sub) nm wavelength. PR-Mo method (already commercially available) was performed for comparison. The procedure was performed with designated measurement parameters and the calibrator of manufacturers. Urine specimens were collected from in- and outpatients in Kyushu University Hospital.
RESULTS
The within-run CVs of the present method with human serum albumin (HSA) solution (150 and 1000 mg/L) were 2.45% and 0.49%, respectively (n=20). The present method showed linearity from 0 to 4000 mg/L. Analytical recovery was 106%. Each response with α, β-globulin and γ-globulin was 98% and 97%, respectively, based on the reaction for albumin. With regard to the correlation with PR-Mo method (x) and our present method (y), the linear regression formula was y = 1.24 x + 30.9, and the correlation coefficient was 0.95 (n=48).
CONCLUSION
We consider this method can be adapted for not urine samples but also other body fluids (ex. marrow liquid) in a clinical laboratory, because it gives the almost same performance for main proteins, and it also has stabilities and accuracies.
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外園 栄作, 栢森 裕三, 久保田 亮, 芝 紀代子, 臨地実習実施前後における学生の教育効果と精神的ストレスについての検討, 生物試料分析科学会, 2014.03. |
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外園 栄作, 太田 英里, 木内 幸子, 大澤 進, 栢森 裕三, 金属錯体法を用いた新しい微量高感度総蛋白測定試薬の開発, 日本臨床検査自動化学会, 2013.10, 【背景・目的】各種腎・尿路系疾患において，尿中総蛋白を定量する事は，その病態を把握し，また，治療の効果などを把握することが可能であるなど，血中の蛋白同様，臨床上その意義は大きい．２型糖尿病患者の増加に伴い，糖尿病性腎症による透析の導入件数が増加している．この糖尿病性腎症は非常に緩やかな経過をたどり，ついには慢性腎不全に陥る疾患であるが，この腎症の程度を観察するには腎生検が最も確実な方法である．しかし，この方法は侵襲的で，患者への負担が大きい為，実際の臨床では，尿蛋白や尿クレアチニンなどの腎機能を反映する検査を用いることでその進行度や治療の経過を把握しているのが現状である．
早期腎症の検査法としては微量アルブミン検査法が利用されているが、アルブミン以外にも低分子の微量な蛋白が尿中に認められるため，その微量の総蛋白を定量し把握することは，糖尿病性腎症の早期診断や経過を観察する上で非常に重要である．現在，尿中の総蛋白測定法としてはピロガロールレッド・モリブデン錯体法（PR-Mo法）が主に用いられている．しかし，この方法は微量蛋白や尿中の全ての蛋白を確実に測り込めているわけではない．例えば，腎尿細管障害マーカーであるβ2-ミクログロブリンなどの低分子蛋白への反応性は4割程度であるのが現状である．よって早期にあらゆる種類の微量な蛋白を高感度に測定できる測定法の開発が求められている．
そこで本研究では，高感度でかつ各種蛋白間における反応性に差が少ない高感度微量総蛋白測定法を目指し，金属錯体法を用いた新しい微量蛋白測定試薬の開発・検討を行うことを目的とする．
【検討方法】
１）金属-金属錯体の組み合わせ検討：様々な金属の中から各種キレート剤と蛋白との間に特異的に結合・呈色する金属を検索する．
２）緩衝液の種類・ｐHの検討：より高感度で蛋白種検出差異の少ない発色系の条件を検討する．
３）特異性試験：作成した発色試薬を用いて尿中に存在する各種蛋白成分との反応性を検討する．
【結果】
トリフェニールメタン系キレート試薬と3〜12属の金属の組み合わせの中から，高感度で蛋白種による発色差異が少ない検出系を見いだした．その定量特性は以下の通りである．再現性はCV=0.49%（100mg/dL），直線性は0〜4000 mg/L，最小検出感度は40 mg/L，添加回収試験は94〜98%，蛋白の反応性はアルブミンを100%とするとα,β-グロブリン（98%），γ-グロブリン（98%）である．
【まとめ】
今回検索した金属-金属錯体の中から蛋白と特異的に結合・呈色をする組み合わせを見出すことができた．開発目標の基礎的性能を達成し，従来法と比較して各種蛋白との反応性も優れていることから尿中微量総蛋白測定試薬として本法は有用ではないかと考えられた．今後，臨床応用に進める予定である．
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溝口 義浩, 津波 勇二, 藤永 雄介, 外園 栄作, 『蛋白陰性尿中における硝子円柱出現様式と尿中Tamm-horsfallムコ蛋白（ＴＨＰ）量の関連性および慢性腎臓病(CKD)，心血管疾患（ＣＶＤ）における早期マーカーとしての尿中THP測定法の有用性の検討』～第1報～, 福岡県医学検査学会, 2013.06. |
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Eri Ohta, Eisaku Hokazono, Yuzo Kayamori, Development of the enzymatic method of serum ethanolamine and examination of its clinical
utility
, the Asian Society of Clinical Pathology and Laboratory Medicine, 2012.11, Ethanolamine (EA) is mainly hydrolyzed from phosphatidyl ethanolamine (PE) by phospholipase D (PLD) in vivo. A study reported that urine EA increased in newborns as Zellweger syndrome, a congenital metabolic disease, but its concentration in blood and clinical significance in adults were not clarified. Recently, a metabolomics study using mass spectrometry reported that EA in saliva of pancreatic cancer patients increased significantly. Therefore, our purposes are to develop a rapid and simple enzymatic method with an amine oxidase involving copper from Arthrobacter sp. (AAO) (EC 1.4.3.6) and to examine the clinical meaning of EA in serum. In our measurement method, reagent 1 (R-1) contained 0.1 mol/L HEPES buffer (pH 8.2 at 25ºC), 1.6 mmol/L TOOS, 5.0 kU/L POD, 1.12 mmol/L N-ethylmaleimide, 16.8 kU/L L-ascorbate oxidase (ASOD) and 7.47 mmol/L NaN3. Reagent 2 (R-2) contained 0.1 mol/L HEPES buffer (pH 8.2 at 25ºC), 20.0 kU/L AAO and 0.4 mmol/L 4-aminoantipyrine. The assay used a Hitachi 7170 type analyzer. A 10 µL specimen was mixed with 180 µL R-1; after incubation for 5 min at 37 ºC, 90 µL R-2 was added; after another 5 min, the mixture was measured using a 2-point end assay performed at 37 ºC, with wavelengths of 700/546 (sub/main wavelength). The within-run CVs of the present method with three kinds of EA solutions ranged 0.43-7.13% (n=10). The standard curve showed linearity from 0 to 800 µmol/L. Analytical recovery was 98.4%. The reference interval of EA in normal was 8.17 ± 4.83 µmol/L (n=19). EA in hepatocellular carcinoma patient sera was significantly higher than normal. In conclusion, our method for serum EA is suitable for routine clinical use in the laboratory for determination of accuracy and simplicity. We consider EA in serum may be a new biomarker of hepatocellular carcinoma.. |
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外園 栄作、為實 秀人、太田 英里、瀬戸 眞奈美、前村 香里、山本 雄彬、大澤 進, 血清Phosphatidylethanolamineの酵素的測定法の開発とその臨床的有用性の検討, 生物試料分析科学会, 2012.03. |
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太田 英里、磯部 厚志、瀬戸 眞奈美、前村 香里、山本 雄彬、外園 栄作、大澤 進, 血中Ethanolamineの酵素的測定法の開発とその臨床的有用性の検討, 日本臨床化学会九州支部総会・日本臨床検査医学会九州地方会, 2012.02. |
| 65. |
外園 栄作、中野 倫太、小口 雄二、大澤 進, MRI造影剤の影響を回避した新しい血清カルシウム測定試薬の検討, 臨床化学会, 2010.09. |
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外園 栄作、甲木 宏美、大澤 進, 改良型マイクロTP-ARによる尿中総蛋白測定試薬の基礎的性能評価, 日本臨床検査自動化学会, 2009.10. |
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外園 栄作、小島 夫美子、大澤 進, キサンテン系色素を用いた新しい尿沈渣染色・保存液の検討, 福岡県医学検査学会, 2009.06. |
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上野 智美、外園 栄作、大澤 進, 日立クリニカルアナライザS40を用いたカルシウム測定の基礎的検討, 日本臨床検査自動化学会, 2008.10. |
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垰田 直美、外園 栄作、大澤 進, 小型自動分析装置S40を用いたアンモニア測定系の基礎的検討, 日本臨床検査自動化学会, 2008.10. |
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外園 栄作、垰田 直美、大澤 進, 過ヨウ素酸ナトリウムを用いたICG検査法の自動分析装置への試み, 日本臨床検査自動化学会, 2008.10. |
| 71. |
外園 栄作、大澤 進, 測定原理の異なる血清総カルシウム測定試薬の比較検討, 日本臨床検査学教育学会, 2007.08. |
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E.HOKAZONO , T.NAKANO , Y.OGUCHI , S.OSAWA, Development of new measurement method for serum calcium with chlorophosphonazo-Ⅲ, American Association for Clinical Chemistry, 2007.07. |
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外園 栄作、堀田 多恵子、栢森 裕三、大澤 進, 分子内に砒素を含まない新しいキレート試薬を用いた血清総カルシウム測定試薬の評価, 日本臨床検査自動化学会, 2006.10. |
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外園 栄作、福島 功平、保坂 俊明、久保田 亮、千葉 泰世、松田 武英、芝 紀代子, 画像処理に基づくセルロースアセテート膜電気泳動のデンシトメトリーの試み, 日本電気泳動学会, 2004.11. |
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外園 栄作、福島 功平、保坂 俊明、芝 紀代子, 全自動電気泳動装置EPA-696を用いた血清蛋白の基礎的検討, 日本臨床自動化学会, 2001.09. |
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外園 栄作、福島 功平、保坂 俊明、芝 紀代子, 全自動電気泳動装置EPA-696を用いたLDアイソザイムの基礎的検討, 日本臨床自動化学会, 2002.09. |
