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Sasaki-Tabata K, Matsuo A, Fuchida H, Ojida A, Tanaka H and Morimoto S, Cloning, expression and characterization of polyketide synthase gene from Scopolia Japonica, The 9th CSP-KSP-JSP Joint Symposium on Pharmacognosy, 2016.05, BACKGROUND AND PURPOSE: Various important pharmacological compounds such as atropine and scopolamine are included in Scopolia japonica. These compounds are synthesized using ornithine as a starting material, however, it’s unclear which enzyme catalyzes the tropinone synthesis reaction. Hence, in the present study we aimed to identify function and structure of novel polyketide synthase (PKS) from S. japonica.
EXPERIMENTAL APPROACH: A total RNA was extracted from leaves of S. japonica and cDNA was synthesized using a reverse transcriptase. Then, degenerate PCR, 5' and 3' RACE was performed using cDNA as a template. Two novel genes were obtained and expressed in E. coli. The recombinant protein was purified with affinity column and ion exchange column. We analyzed the enzyme activity using HPLC. Moreover, we crystallized and performed crystallographic analysis of PKS.
KEY RESULTS: Two novel genes of PKS from S. japonica were obtained. The recombinant PKSs expressed in E. coli as a soluble fraction was highly purified using affinity and ion exchange column and the enzyme assay with HPLC showed that new compounds were synthesized using some substrates. Moreover, crystallization screening resulted in obtaining needle or plate crystals. We could get single crystals in an optimized condition. The crystal diffracted to 2.0 angstrom at KEK-PF and the structures of PKS were determined using molecular replacement method.
CONCLUSION AND IMPLICATIONS: These PKS genes seem to belong to PKS family because they showed high similarity to other CHS from various plants. These novel findings may contribute to clarifying the mechanism of tropane synthesis.. |
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田畑香織, 松尾彩加, 渕田大和, 王子田 彰夫, 田中 宏幸, 森元 聡, ハシリドコロ由来新規ポリケタイド合成酵素に関する研究, 日本生薬学会 第62回年会, 2015.09. |
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佐々木香織、梶川瑞穂、前仲勝実, BmNPVバクミドシステムを用いたカイコでの膜タンパク質の発現, 第１１回日本蛋白質科学会年会, 2011.06, タンパク質の機能解析や構造解析を行うにあたって大量のタンパク質の調製が必要となるが、真核生物由来のタンパク質を生理活性を保持した状態で調製するには大腸菌を用いた発現系では困難な場合が多い。
そこで、我々はバキュロウイルスを利用した昆虫細胞発現系の発展型として、カイコバキュロウイルス（BmNPV）バクミドDNAと、大量生産の期待できるカイコ個体を組み合わせた発現システムを構築した。バキュロウイルスを用いた外来遺伝子の発現系では糖鎖が付加されたものが得られるため、大変有用である。さらに、BmNPVバクミドシステムはカイコに感染可能なバクミドDNAを大腸菌で簡便に作製することができ、ウイルスのタイターを測定するような煩雑な操作が不要である点で優れている。
このBmNPVバクミドシステムを用いて、大腸菌で発現が難しいとされるヒト免疫受容体やGPCRのような膜タンパク質を活性を保持した状態で調製に成功した例を紹介する。. |
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佐々木香織、田浦太志、森元聡、正山征洋, コガネバナのbaicalin代謝酵素に関する研究, 日本生薬学会 第４６回年会, 1999.09. |
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佐々木香織、田浦太志、森元聡、正山征洋, コガネバナのフラボノイド代謝酵素に関する研究, 日本生薬学会 第４７回年会, 2000.09. |
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佐々木香織、Prakairoong Pattanakachorn、森元聡、正山征洋, コガネバナのフラボノイド代謝に関する研究, 日本薬学会 第１２１回年会, 2001.03. |
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佐々木香織、岡本直明、田中卓、正井久雄、前仲勝実、神田大輔, 大腸菌由来PriAとオリゴヌクレオチドとの複合体の結晶化, 日本結晶学会 ２００３年度年会, 2003.12. |
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佐々木香織、尾瀬農之、岡本直明、田中卓、正井久雄、前仲勝実、神田大輔, 大腸菌由来PriAとオリゴヌクレオチドとの複合体の結晶化, 第２７回日本分子生物学会年会, 2004.12. |
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佐々木香織、尾瀬農之、田中卓、前仲勝実、正井久雄、神田大輔, E. coli 由来PriAのN末端ドメインの立体構造解析, 第５回日本蛋白質科学会年会, 2005.06. |
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佐々木香織、尾瀬農之、田中卓、岡本直明、前仲勝実、正井久雄、神田大輔, E. coli 由来PriAのN末端ドメインによるDNA 3’末端認識の構造的基盤, 日本バイオインフォマティクス学会 第１回プロテイン・インフォマティクスワークショップin九州, 2005.10. |
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佐々木香織、尾瀬農之、田中卓、岡本直明、前仲勝実、正井久雄、神田大輔, E. coli 由来PriAのN末端ドメインによるDNA 3’末端認識の構造的基盤, 第２８回日本分子生物学会年会, 2005.12. |
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佐々木香織、尾瀬農之、田中卓、岡本直明、前仲勝実、正井久雄、神田大輔, E. coli 由来PriAのN末端ドメインによるDNA 3’末端認識の構造的基盤, 文部科学省タンパク３０００プロジェクト 第４回産学連携フォーラムin福岡, 2006.03. |
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佐々木香織、梶川瑞穂、黒木喜美子、本橋智子、霜島司、朴龍洙、神田大輔、前仲勝実, BmNPVバクミドシステムを用いたカイコ個体でのヒト免疫細胞表面レセプターKIRの大量発現, 第６回日本蛋白質科学会年会, 2006.04. |
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佐々木香織、尾瀬農之、岡本直明、田中卓、前仲勝実、正井久雄、斉藤美保子、白井剛、神田大輔, PriAタンパク質によるDNA 3’末端の塩基非選択的認識機構の解明, 第７回日本蛋白質科学会年会, 2007.05. |
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佐々木香織、田中卓、正井久雄、前仲勝実、神田大輔, Structural basis for the DNA recognition of PriA protein in the stalled DNA replication fork, 第３０回日本分子生物学会年会・第８０回日本生化学会大会 合同大会, 2007.12. |
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佐々木香織、梶川瑞穂、矢木宏和、近藤幸子、黒木喜美子、本橋智子、霜島司、朴龍洙、加藤晃一、前仲勝実, BmNPVバクミドシステムによるヒト免疫細胞表面レセプターの発現と糖鎖解析, 第８回日本蛋白質科学会年会, 2008.06. |
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佐々木香織、梶川瑞穂、矢木宏和、近藤幸子、黒木喜美子、本橋智子、霜島司、朴龍洙、加藤晃一、前仲勝実, BmNPVバクミドシステムによるヒト免疫細胞表面レセプターの発現と糖鎖解析, 第３１回日本分子生物学会年会・第８１回日本生化学会大会 合同大会, 2008.12. |
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Kaori Sasaki, Toyoyuki Ose, Taku Tanaka, Toshimi Mizukoshi, Tomoko Ishigaki, Naoaki Okamoto, Katsumi Maenaka, Hisao Masai and Daisuke Kohda, Structural analysis of the N-terminal domain of PriA from E. coli, XX Congress of he International Union of Crystallography, 2005.08. |
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Kaori Sasaki, Toyoyuki Ose, Taku Tanaka, Naoaki Okamoto, Katsumi Maenaka, Tsuyoshi Shirai, Hisao Masai and Daisuke Kohda, Structural basis for the recognition of the 3'-terminus of DNA by PriA protein, 20th IUBMB International Congress of Biochemistry and Molecular Biology and 11th FAOBMB Congress, 2006.06. |
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Kaori Sasaki, Structural basis for the stalled replication folk recognition by E. coli PriA, 第１回 研究所ネットワーク国際シンポジウム, 2005.07. |
