| 1. |
真柳浩太, グリーンファルマ構造解析センター, 第1回クライオ電子顕微鏡 施設技術交流会, 2022.11. |
| 2. |
真柳浩太, 電子顕微鏡で「見た」アーキアのDNA 複製装置の仕組み, 第34 回日本Archaea 研究会講演会, 2022.07. |
| 3. |
Kouta Mayanagi, Kazumi Saikusa, Naoyuki Miyazaki, Satoko Akashi, Kenji Iwasaki, Yoshifumi Nishimura, Kosuke Morikawa, and
Yasuo Tsunaka, Key steps in nucleosome reorganization by human FACT as revealed by cryo-EM single particle analysis, Gordon Research Conference 3D Electron Microscopy, 2022.06. |
| 4. |
真柳浩太, 最先端電子顕微鏡カメラで「見る」生体高分子複合体の立体構造, バイオインタラクション研究会 第16回ワークショップ, 2022.03. |
| 5. |
真柳浩太, Cryo-EM network aiming to support drug discovery in the Kyushu / West Japan area, 第59回日本生物物理学会, 2021.11, At the 59th Annual Meeting of the Biophysical Society of Japan in November 2021, six speakers are invited to share the recent results of single particle analysis, tomography, and micro-ED by cryo-EMs, and to discuss the issues to be overcome by technical development. This symposium is cosponsored by the AMED-BINDS.
Dr. Kouta Mayanagi from Kyushu Univ. will talk about the two high-end cryo-EMs (200 kV and 300 kV) to be set up in the fiscal year of 2021 at the Pharmaceutical Research Institute, Kyushu University, which is the Library Screening Section organized by Dr. Shigehiro Ohdo. Using these two new cryo-EMs together with the cryo-EM Polara at Medical Institute of Bioregulation, Kyushu Univ. will promote research support for researchers in academia and pharmaceutical companies in the areas of Kyushu and West Japan. Taking advantage of the characteristics of the above Library Screening Section, they aim to focus on research support for drug discovery research, such as structural analysis using libraries of chemical compounds. In addition, they also plan to utilize the supercomputer ITO (https://www.cc.kyushu-u.ac.jp/scp/system/ITO/) to build a standard single particle analysis environment, easy and convenient for beginners.. |
| 6. |
沖啓輔，真柳浩太，宮崎直幸，石野園子，山上健，森川耿右，岩崎憲治, 神田大輔，白井剛，石野良純, Two conformations of DNA polymerase D-PCNA-DNA complex in a hyperthermophilic archaeon Thermococcus kodakarensis, 2020年度 日本フードファクター学会・ 日本農芸化学会西日本支部 合同大会, 2020.11. |
| 7. |
山上 健， 沖 啓輔， 高島 夏希， 高藤 三加， 真柳 浩太， 石野 園子， 石野 良純, Thermococcus kodakarensis由来ファミリーD DNAポリメラーゼの調製法の改良とその生化学的解析, 第42回日本分子生物学会年会, 2019.12. |
| 8. |
三輪 正直， 香山 賢一， 真柳 浩太， 中江 摂， 西 義介， 白井 剛, 単粒子電子顕微鏡による全長ヒトポリ(ADP-リボース)合成酵素１の2量体構造, 第42回日本分子生物学会年会, 2019.12. |
| 9. |
沖 啓輔， 山上 健， 永田 麻梨子， 真柳 浩太， 沼田 倫征， 石野 園子， 石野 良純, PolD上での相互作用因子スウィッチングによるアーキア特有のレプリソーム機能変換機構の提唱, 第42回日本分子生物学会年会, 2019.12. |
| 10. |
津中 康央， 真柳 浩太， 七種 和美， 宮崎 直幸， 明石 知子， 岩崎 憲治， 西村 善文， 森川 耿右, FACTによって引き起こされるヘキサゾーム構造の電子顕微鏡解析, 2019.12. |
| 11. |
白石 大智， 片山 雄太， 西山 正章， 真柳 浩太 ，神田 大輔， 浦 聖恵， 鯨井 智也， 胡桃坂仁志， 中山 敬一, クロマチンリモデリング因子CHD8の機能異常によるASD発症の分子基盤の解明, 第42回日本分子生物学会年会, 2019.12. |
| 12. |
真柳 浩太，沖 啓輔，宮崎 直幸，石野 園子，山上 健，岩崎 憲治，森川 耿右，神田 大輔，白井 剛，石野 良純, クライオ電子顕微鏡によるPolD-PCNA-DNA複合体の構築様式及び切換え機構の解析, 第42回日本分子生物学会年会, 2019.12. |
| 13. |
Yuki Kawasaki, Hirotaka Ariyama, Daisuke Fujinami, Hajime Motomura, Ashutosh Srivastava, Florence Tama, Daisuke Noshiro,
Toshio Ando, Kouta Mayanagi, Daisuke Kohda, Integrative Analysis Combining AFM, NMR, and EM Revealed Two-State Conformational Exchange of a Single-subunit
Oligosaccharyltransferase from Archaeoglobus fulgidus., 15th International Congress on Thermophiles, 2019.09. |
| 14. |
Keisuke Oki, Mariko Nagata, Sonoko Ishino, Takeshi Yamagami, Tomoyui Numata, Kouta Mayanagi, and Yoshizumi Ishino, Interactions of helicase, DNA polymerase, and primase to form functional replisome in the hyperthermophilic archaeon, Thermococcus kodakarensis., 15th International Congress on Thermophiles, 2019.09. |
| 15. |
Kouta Mayanagi, Sonoko Ishino, Tsuyoshi Shirai, Takuji Oyama, Shinichi Kiyonari, Daisuke Kohda, Kosuke Morikawa, Yoshizumi Ishino, Direct Visualization of DNA Baton Pass between Replication Factors Bound to Archaeal Okazakisome., 15th International Congress on Thermophiles, 2019.09. |
| 16. |
川崎由貴， 有山弘高， 藤浪大輔， 本村肇， Ashutosh Srivastava, Florence Tama， 能代大輔， 安藤敏夫， 真柳浩太， 神田大輔
, 統合的なAFM, NMR, 電顕単粒子解析により明らかにされたオリゴ糖転移酵素の動的構造., 第38回日本糖質学会年会, 2019.08. |
| 17. |
石野園子、真柳浩太、白井剛、清成信一、今井奈美子、大山拓次、山上健、石野良純, 超好熱性アーキア由来クランプPCNA 上で働くDNA 複製タンパク質の生化学および構造の解析, 日本農芸化学会2019年度大会, 2019.03. |
| 18. |
Yoshizumi Ishino, Keisuke Oki, Mariko Nagata, Kouta Mayanagi, Tsuyoshi Shirai, Takuji Oyama, Kosuke Morikawa, Takeshi Yamagami, and Sonoko Ishino, Replisome structure and its functions in Archaea, OKAZAKI Fragment Memorial Symposium: Celebrating the 50th anniversary of the discontinuous DNA replication model, 2018.12. |
| 19. |
真柳浩太, 沖啓輔, 石野園子, 宮崎直幸, 岩崎憲治, 神田大輔, 白井剛, 石野良純, クライオ電顕で「見る」古細菌複製フォーク複合体の機能構造, 第41回日本分子生物学会年会, 2018.11, DNAの複製には多数の蛋白質が関わり、一般的に互いに結合して複合体を形成し、その機能を担っている。これらの超分子複合体は柔軟な構造を持ち、構成因子を刻一刻とダイナミックに変化させるものも多く、結晶構造解析が一般的に困難である。個々の分子の実像が観察可能なクライオ電顕を用いた単粒子解析法は、このようなターゲットに対して非常に有効である。特に近年の「電子直接検出(DED)カメラ」の発展により、結晶構造解析に迫る分解能の解析が可能となり、大変に注目されている。我々はこれまで、構造解析に適した超好熱古細菌の系を中心に、レプリソームの機能構造連関を単粒子解析を用いて研究してきた。本講演では最新のク ライオ電顕技術を用いて得られたPolDとDNAクランプ、及び基質DNAから構成される複合体の構造的知見について報告する。 PolBが大変に良く研究されPCR等への応用が進んでいるのに対し、PolDは優れた伸長活性、校正反応活性を有しながら、特に構造に関する研究が進んでいない。近年、ようやく構成サブユニットDP1及びDP2の部分結晶構造が報告されたが、全体構造の解析例は皆無であり、サブユニット組成さえ未知である。PolDもPolB同様、生体中ではDNAクランプPCNAに結合することでその機能を活性化させる。 ゲル濾過により機能構造であるPolD-PCNA-DNA複合体を精製、凍結ロボットによって非晶質の氷中に包埋し、クライオ電子顕微鏡を用いて複合体の粒子像を撮影した。高感度、且つ高速の「動画撮影」が可能なDEDカメラを用い、さらに粒子像のコントラストを向上させる「位相板」を使用することで分解能の向上を図った。解析の結果、複合体の全体構造及びDP1、DP2の配置が明らかになった。また溶液中に２通りの構造が混在していることがわかった。両構造ともアルファーヘリックスが明確に可視化されており、更に結晶構造には含まれていない領域の可視化にも成功している。. |
| 20. |
沖啓輔, 山上健, 永田麻梨子, 高島夏希, 真柳浩太, 白井剛, 石野園子, 石野良純, 超好熱性アーキアThermococcus kodakarensis由来ファミリーD DNAポリメラーゼの分子解剖による機能分布の解明, 第41回日本分子生物学会年会, 2018.11. |
| 21. |
津中康央, 真柳浩太, 七種和美, 七種和美, 宮崎直幸, 明石知子, 岩崎憲治, 西村善文, 森川耿右, ヌクレオソーム構造変換におけるFACT酸性天然変性領域の新たな分子機能
, 第41回日本分子生物学会年会, 2018.11. |
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真柳浩太, DNA-蛋白質複合体の単粒子解析, 生理研研究会2018, 2018.11, 我々はこれまで主にDNAの複製・修復・組換えや、転写に関わる超分子複合体の構造を単粒子解析を用いて解析してきた。これらの超分子複合体は、反応の各段階で構成因子の会合及び解離を適宜行うことで、適切に複合体を再編成させて、一連の反応を綿密に制御している。従ってその機構を理解するためには,個々の構成因子の結晶構造だけでは不十分であり、複合体全体の構造解析が必須であるが、DNAを含み且つこのように常に構造変化を伴う複合体の結晶化は容易ではない。「単粒子解析法」は、試料の結晶化の必要がなく、このような超分子複合体の立体構造解析に最適である。特に近年「電子直接検出カメラ」の開発により分解能が飛躍的に向上し、結晶構造解析と互角となっている。
FACTはヌクレオソーム中のヒストンH2A/H2Bを引き抜くことでヌクレオソーム構造を破壊し、クロマチンのリモデリングを行う。近年、この反応を担うFACTのMidドメインとヒストンの結晶構造が２報発表されたが結果は一致せず、ヌクレオソーム全体との複合体の解析が待たれる状況であった。我々は収差補正機構を備えた最先端のクライオ電子顕微鏡、電子直接検出カメラ、位相板等を用いてMidドメインとヌクレオソームの構造解析を行った。対象となる粒子は１６万〜２０万程度とやや小さいため、特に位相板の使用が効果的であった。立体構造解析の結果、FACTとヌクレオソームの反応の生成物であるヘキサソームの構造が得られた。更に、MidのC末端から伸びる天然変性領域であるAIDセグメントがDNAと置き換わる形でヌクレオソームに侵入する様子を捉えることに成功し、ヌクレオソームの不安定化の機構の一端を明らかにすることができた。. |
| 23. |
Yuki Kawasaki, Kouta Mayanagi, Ashutosh Srivastava, Hirotaka Ariyama, Florence Tama, Toshio Ando, and Daisuke Kohda, Integrative approach combining electron microscopy and high-speed AFM revealed the dynamic conformational exchange of the oligosaccharyltransferase in lipid bilayers, 第13回研究所ネットワーク国際シンポジウム,, 2018.10. |
| 24. |
Sonoko Ishino, Kouta Mayanagi, Tsuyoshi Shirai, Shinichi Kiyonari, Namiko Imai, Takuji Oyama, and Yoshizumi Ishino, Biochemical and Structural analyses of replication proteins bound to PCNA, 12th International Congress on Extremophiles, 2018.09. |
| 25. |
Keisuke Oki, Takeshi Yamagami, Mariko Nagata, Natsuki Takashima, Kouta Mayanagi, Sonoko Ishino, and Yoshizumi Ishino, Family D DNA polymerase tethers primase and helicase in the replisome in Thermococcus kodakarensis, 12th International Congress on Extremophiles, 2018.09. |
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真柳浩太, FACT-ヌクレオソーム複合体の単粒子解析, 第2回 エピジェネティック因子の構造と機能をつなぐ会, 2018.09. |
| 27. |
真柳浩太, クライオ電顕で見る超分子複合体の立体構造, 第42回蛋白質と酵素の構造と機能に関する九州シンポジウム, 2018.08, 近年、超解像技術の発展等により、細胞中の様々な因子の局在、動態については光学顕微鏡によって非常に詳細な情報がリアルタイムでモニター可能となっている。一方それら各因子の構造についても、おもに結晶構造解析による網羅的解析がなされ、既に膨大な原子座標データが蓄積されている。しかしながら、両者はその間に横たわるナノメータレンジの解析手段のギャップの存在によって、必ずしも有機的に結びつけられていない。
生体内で蛋白質は、互いに結合して複合体を形成し、その機能を担っていることが多い。これらの超分子複合体はその構造、構成因子を刻一刻変化させるものも多く、またその大きさも正に前述のナノメータレンジに相当することから、これまで結晶構造解析などによる解析が一般的に困難であった。電子顕微鏡は細胞レベルから原子レベルまで、非常にワイドなスケールレンジを誇り、このギャップを埋め得る有望な手段である。特に個々の分子の実像を直視できる電子顕微鏡の特性を活かした、「単粒子解析法」は、試料の結晶化の必要がなく、超分子複合体の立体構造解析に最適である。
本手法では生体超分子複合体を、急速凍結により溶液中の機能構造を保ったまま薄い氷中に保持し、電子顕微鏡で撮影した多数の粒子像から、計算機を用いてその立体構造を再構成する。その際、生体試料が一般的に電子線に脆弱であるため、電子線量を極度に下げた「暗い」撮影条件で画像を記録する必要があり、電子顕微鏡の装置自体は高分解能であるにも拘らず、これまで単粒子解析法による原子レベルの解析が大変に困難であった。
実際、昨年ノーベル賞を受賞したR. Henderson博士は1995年に、分子量１０万程度の複合体の画像を一万粒子ほど解析することで、３Åの原子分解能が得られると“予言”していたものの、５、６年前までメガダルトンを超えるリボソームのような巨大分子ですら、数十万〜数百万の粒子を解析しても原子分解能に到達するのが困難であった。
近年、高感度で且つ高速の動画撮影が可能な「電子直接検出カメラ（DED）」が開発されたことにより、従来「静止画」で撮影していた電顕画像データを動画で撮影したところ、露光中に被写体である粒子が動いていたことが確認され、フレーム毎にこの動きを戻して補正することで、飛躍的に分解能が向上することが示された。このことにより、単粒子解析法は今では結晶構造解析と互角の分解能を実現できるまでになった。本講演ではこの単粒子解析法を概説したのち、本手法を用いて得られた成果等について報告する。
我々はこれまで主にDNAの複製・修復・組換えや、転写に関わる超分子複合体の構造を単粒子解析を用いて解析してきた。これらの超分子複合体は、反応の各段階で構成因子の会合及び解離を適宜行うことで、適切に複合体を再編成させて、一連の反応を綿密に制御している。従ってその機構を理解するためには,個々の構成因子の結晶構造だけでは不十分であり、複合体全体の構造解析が必須であるが、DNAを含み且つこのように常に構造変化を伴う複合体の結晶化は容易ではない。そのため、個々の因子の結晶構造から全体の構造を組み上げて推察する方法も多くとられてきたが、我々が解析してきた単粒子解析による「全体」構造は多くの場合、これら提唱モデルと異なっていた。
１） オカザキソームの解析
ラギング鎖の複製は主に3つの因子、ポリメラーゼ、フラップエンドヌクレアーゼ、リガーゼによって行われ、これらが順次切り替わることで、オカザキ断片の生成・連結が進行する。その際、ポリメラーゼを活性化するPCNAクランプが3量体であることから、3因子全てを同時に1つのPCNAクランプ上に保持し効率を向上させる「ツールベルトモデル」が提唱されていた。我々はこれまで、Pol-PCNA-DNA（参考文献5）, Lig-PCNA-DNA（参考文献6）, FEN-PCNA-DNA等の構造や、因子が切り替わる遷移状態のLig-FEN-PCNA-DNAの構造を解析してきたが、何れの結果も従来のモデルでは説明が困難であり、PCNAが単なる留め金ではなく、これまで考えられていた以上に因子の切り替えの制御に寄与している事が明らかになった。
２） ヌクレオソーム・リモデリング因子複合体の解析
オカザキソームの解析には従来のCCDカメラを用いたのに対して、本サンプルはDEDカメラで解析を行った。またサンプルの大きさが２０万程度と小さいため、このような対象に有効な「位相板」を活用した。その結果大幅に分解能を向上させることができ、ヌクレオソーム不安定化の機構を明らかにすることができた。. |
| 28. |
Kouta Mayanagi, Single particle analysis of FACT-Nucleosome complex, 新学術領域「染色体OS」第6回領域会議, 2018.02. |
| 29. |
真柳浩太, DNA複製フォーク複合体の構築原理及び遷移・制御機構の解明, 第10回さきがけ構造生命領域会議, 2017.12. |
| 30. |
Kouta Mayanagi, Keisuke Oki, Sonoko Ishino, Naoyuki Miyazaki, Kenji Iwasaki, Daisuke Kohda, Tsuyoshi Shirai, Yoshizumi Ishino
, Single particle analysis of PolD‒PCNA‒DNA complex, 第40回日本分子生物学会年会, 2017.12, DNA polymerase PolB of the hyperthermophilic archaea is widely used in genetic engineering tools such as PCR, because of its outstanding stability under high temperature. All Archaea, except Crenarchaea have PolD in addition to PolB. Several recent studies have proved that PolD but not PolB is essential for genome replication. Though PolD has an excellent elongation as well as proofreading activity, it has never been applied to biotechnological tools such as PCR, due to the limited structural knowledge. Recently, the crystal structures of the core region of the PolD subunits DP1 and DP2 have been reported. However, the overall structure of PolD is not known in detail, till now.
We have successfully established a purification method of the full length PolD, and by mixing PCNA and primed DNA, we could purify the reconstituted PolD-PCNA-DNA complex, by gel filtration. The 3D structure of this complex was investigated by cryo electron microscopic single particle analysis. In order to improve the resolution of the 3D map, frozen hydrated samples were examined by Titan Krios cryo EM equipped with a Volta phase plate, and images were recorded with a direct electron detector (DED) camera.
The obtained 3D map exhibited not only the double helical structure of DNA, but also fine structures corresponding to the α helices of PolD. We could construct the atomic model of the whole complex by docking the individual crystal structures of PCNA, DP1, and DP2 into the obtained 3D map.
ave successfully established an purification method of the full length PolD, and by mixing PCNA and primed DNA, we could purify the reconstituted PolD-PCNA-DNA complex, by gel filtration. The 3D structure of this complex was investigated by cryo electron microscopic single particle analysis. In order to improve the resolution of the 3D map, frozen hydrated samples were examined by Titan Krios cryo EM equipped with a Volta phase plate, and images were recorded with an electron detector camera. The obtained 3D map exhibited not only the double helical structure of the DNA, but also fine structures corresponding to the α helices of the PolD. We could construct the atomic model of the whole complex by docking the individual crystal structures of PCNA, DP1, and DP2, into the obtained 3D map.. |
| 31. |
真柳浩太, FACT-Nucleosome複合体の単粒子解析, 新学術領域「染色体OS」第5回領域会議, 2017.09. |
| 32. |
真柳浩太, 電子顕微鏡で「見る」生体超分子の構造−革新的発展を続ける単粒子解析, JASIS 2017 ライフサイエンスイノベーション, 2017.09. |
| 33. |
真柳浩太, DNA複製フォーク複合体の構築原理及び遷移・制御機構の解明, 第9回さきがけ構造生命領域会議, 2017.05. |
| 34. |
Kouta Mayanagi, Single particle analysis of FACT-Nucleosome complex, The 4th Meeting on GRANT-IN-AID FOR SCIENTIFIC RESEARCH ON INNOVATIVE AREAS “CHROMOSOME ORCHESTRATION SYSTEM”, 2017.02. |
| 35. |
真柳浩太, 電顕単粒子解析による生体高分子複合体の立体構造決定, 第8回構造生物学に関する先端技術講演会, 2017.01. |
| 36. |
真柳浩太, DNA複製フォーク複合体の構築原理及び遷移・制御機構の解明, さきがけ – ライフサイエンスの革新を目指した構造生命科学と先端的基盤技術- 研究領域研究成果報告会, 2017.01. |
| 37. |
Kouta Mayanagi, Single particle analysis of DNA replication fork complex, 10th International 3R (DNA, Replication, Recombination, and Repair) Symposium, 2016.11, We have been studying the mechanism of synthesis and maturation of Okazaki fragments, in which three replication factors, i.e. DNA polymerase, Flap endonuclease (FEN), and DNA ligase, are playing essential roles. As all of these three enzymes are known to interact with PCNA, a switching mechanism between these factors, bound simultaneously to a PCNA ring has been proposed, called PCNA tool belt model, which is considered to increase the efficiency of these sequential reactions. Recent biochemical studies, however, suggest sequential binding and releasing of these factors. Little is known regarding the precise switching mechanism, due to the lack of the structural knowledge of these complexes.
We investigated the structures of the core components of the replisome, such as DNA polymerase-PCNA-DNA, and DNA ligase-PCNA-DNA, by single particle analysis. Besides the known interaction through a PIP-box motif, we could find a novel contact between polymerase and PCNA, as well as between ligase and PCNA. Mutant analysis showed that these contacts are involved in the regulation of the replication factors, such as the switching between the polymerizing and editing modes of the polymerase. Our results, showing that both factors are bound to two subunits of the PCNA trimer, were inconsistent with the standard tool belt model. The third PCNA subunit, however, was still free in both complexes, thus we analyzed the complex structures with two replication factors. We could successfully visualize the 3D structure of FEN-DNA ligase-PCNA-DNA complex, and the handing over of the ds DNA from FEN to DNA ligase.. |
| 38. |
Mayanagi K, Ishino S Takafuji M, Mitsuoka K, Shirai T, Kiyonari S, Nishida H, Kohda D, Morikawa K, Ishino Y., Switching mechanism of the replisome as revealed by single particle analysis, 第 89 回日本生化学会大会, 2016.09, DNA replication in archaea and eukaryotes is executed by family B DNA polymerases, which exhibitfull activity when complexed with the DNA clamp, proliferating cell nuclear antigen (PCNA). PCNAhas a trimeric ring structure that encircles the DNA, and increases the processivity of the bound DNApolymerase by tethering it to the DNA. It is known now, that PCNA also interacts with multiple partnersto control DNA replication, DNA repair, and cell cycle progression, and works not only as the platform,but also as the conductor for the recruitment and release of these factors. However, the moleculararchitectures as well as the mechanism of the regulation of these replication factors are not known indetail.We have investigated the three-dimensional structure of the core components of the replisome,such as DNA polymerase-PCNA-DNA, and DNA ligase-PCNA-DNA ternary complexes, by singleparticle analysis (2- 3). Besides the authentic interaction through a PCNA-interacting protein box (PIPbox),we could find a novel contact between both polymerase-PCNA and ligase-PCNA. Mutant analysisshowed that these contacts are involved in the regulation of the replication factors, such as the switchingbetween the polymerizing and editing modes of the polymerase. Our results, showing that both factorsbound to two subunits of the PCNA trimer ring, were inconsistent with the standard tool belt model. Thethird PCNA subunit, however, was still free in both complexes, thus we analyzed the complex structureswith two replication factors bound to one PCNA ring, in order to investigate the switching mechanismbetween them in more detail.. |
| 39. |
Mayanagi K, Ishino S Takafuji M, Mitsuoka K, Shirai T, Kiyonari S, Nishida H, Kohda D, Morikawa K, Ishino Y., Switching mechanism of DNA replication fork complex revealed by single particle analysis, The 16th European Microscopy Congress, 2016.08. |
| 40. |
真柳浩太, 電子顕微鏡による染色体動態を担う超分子複合体の構築原理及び制御・遷移 機構の研究, 新学術領域研究 「染色体オーケストレーションシステム」 第3回 領域会議,, 2016.07. |
| 41. |
Kouta Mayanagi, Molecular switching of DNA replication fork complex revealed by single particle analysis, The 1st APPA-PSSJ joint workshop, 2016.06, Okazaki fragments synthesis and maturation, during lagging strand DNA replication, is accomplished by mainly three replication factors, i.e. DNA polymerase, Flap endonuclease, and DNA ligase. All of these three enzymes are known to interact with the DNA clamp, proliferating cell nuclear antigen (PCNA), through a PCNA-interacting protein box (PIP-box) motif. PCNA forms a trimeric ring that encircles the DNA, and increases the processivity of the bound DNA polymerase by tethering it to the DNA. As up to three replication factors could be bound to a PCNA trimer, a switching mechanism between these replication factors, bound simultaneously to a PCNA ring has been proposed, called PCNA tool belt model, which is considered to increase the efficiency of the sequential reactions. However, the precise mechanism is not known in detail, due to the lack of structural data of such complexes. In order to investigate the mechanism of the regulation and switching of these replication factors bound to PCNA, we have studied the molecular architectures of the core components of the replisome, such as DNA polymerase-PCNA-DNA, and DNA ligase-PCNA-DNA complexes, by single particle analysis.. |
| 42. |
＃高島夏希, 石野園子, 高藤三加, 真柳浩太, ＃松尾亮太郎, 山上 健, 石野良純, Molecular anatomy of DNA polymerase D for functional elucidation of each subunit, DP1 and DP2, 第16回日本蛋白質科学会, 2016.06. |
| 43. |
高島 夏希， 石野 園子， 高藤 三加， 真柳 浩太， 原 智彦， 山上 健， 石野 良純, 超好熱性アーキアThermococcus kodakarensis由来ファミリーD DNAホリメラーセの構造と機能の相関, 第38回日本分子生物学会年会・第88回日本生化学会大会・合同大会, 2015.12. |
| 44. |
真柳浩太, DNA複製フォーク複合体の構築原理及び遷移•制御機構の解明, さきがけ-ライフサイエンスの革新を目指した構造生命科学と先端的基盤技術- 研究領域 研究成果報告会, 2015.11. |
| 45. |
Kouta Mayanagi, Single particle analysis of DNA replication fork complex, The 25th Hot Spring Harbor International Symposium, “Cutting Edge of Technical Innovations in Structural and Systems Biology”, 2015.11. |
| 46. |
川崎由貴， 眞柳浩太， 神田大輔, オリゴ糖転移酵素AglBのナノディスクへの再構成と電顕単粒子解析, 平成27年度日本生化学会九州支部例会, 2015.05. |
| 47. |
真柳 浩太, DNA複製フォーク複合体の分子構築及び切換え機構の研究, 蛋白研セミナー, 2014.02. |
| 48. |
Hiromi Ogino, Sonoko Ishino, Kouta Mayanagi, Takuji Oyama, Tsyoshi Shirai, Kosuke Morikawa, Gyri Teien Haugland, Nils-Kare Birkeland, Daisuke Kohda, Yoshizumi Ishino, Divergently evolved activation mechanism of the replicative helicase in the thermophilic archaeon, Thermoplasma acidophilum, 第36回日本分子生物学会, 2013.12. |
| 49. |
真柳 浩太, DNA複製に関与する超分子複合体の単粒子解析, 日本顕微鏡学会第57回シンポジウム, 2013.11. |
| 50. |
尾木野弘実, 石野 園子, 真柳 浩太, 大山 拓次, 白井 剛, 森川 耿右, Gyri Teien Haugland, Nils-Kare Birkeland, 神田 大輔, 石野 良純, 好熱性アーキアThermoplasma acidophilumにおける複製ヘリカーゼ活性化機構の分岐進化, 第１４回極限環境生物学会, 2013.10. |
| 51. |
Kouta Mayanagi, Electron microscopic structure analysis of protein-DNA complexes, The 3rd International conference on New Frontier of the Research on RecA-family recombinases and their accessory proteins, 2013.10. |
| 52. |
Kenichi Koyama, Kouta Mayanagi, Takayuki Eguchi, Hiroyuki Morita, Kazuo Kamemura, Yoshitake Nishi, Masano Miwa, Tsuyoshi Shirai, 組み換えhuman poly(ADP-ribose) polymerase 1の精製と予備的構造解析, 第８６回日本生化学会大会, 2013.09. |
| 53. |
Hiromi Ogino, Sonoko Ishino, Kouta Mayanagi, Takuji Oyama, Tsyoshi Shirai, Kosuke Morikawa, Gyri Teien Haugland, Nils-Kare Birkeland, Daisuke Kohda, Yoshizumi Ishino, Activation mechanism of the replicative helicase in the thermophilic archaeon, Thermoplasma acidophilum, Thermophiles 2013, 2013.09. |
| 54. |
Kouta Mayanagi, Electron microscopic analysis of molecular architecture and switching mechanism of DNA replication fork complex, ICSG2013-SLS, 2013.07. |
| 55. |
Kouta Mayanagi, Shinichi Kiyonari, Hirokazu Nishida, Sonoko Iahino, Mihoko Saito, Daisuke Kohda, Yoshizumi Ishino, Tsuyoshi Shirai, Kosuke Morikawa, Molecular architecture and switching mechanism of DNA replication fork complex, Gordon Research Conferences: Three Dimensional Electron Microscopy, 2013.06. |
| 56. |
尾木野弘実, 石野 園子, 真柳 浩太, 大山 拓次, 白井 剛, 森川 耿右, Gyri Teien Haugland, Nils-Kare Birkeland, 石野 良純, Thermoplasma acidophilum由来Cdc6/Orc1とホモ4量体のGINSによるMCMとの相乗的な活性化, 第35回日本分子生物学会年会, 2012.12. |
| 57. |
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真柳浩太、清成信一、西田洋一、斉藤美保子、神田大輔、白井剛、石野良純、森川耿右, The molecular switching mechanism of replication factors as revealed by electron microscopic single particle analysis
電子顕微鏡単粒子解析による複製因子の切換機構の研究, 分子生物学会, 2011.12. |
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Hiromi Ogino, Sonoko Ishino, Kouta Mayanagi, Gyri Teien Haugland, Nils-Kare Birkeland, Akihiko Yamagishi, Yoshizumi Ishino, The GINS complex from the thermoacidophilic archaeon, Thermoplasma acidophilum may function as a homotetramer in DNA replication, 第34回日本分子生物学会, 2011.12. |
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尾木野弘実, 石野 園子, 真柳 浩太, Gyri Teien Haugland, Nils-Kare Birkeland, 石野 良純, 山岸明彦, Homotetramer of Gins protein from the thermoacidophilic archaeon, Thermoplasma acidophilum as a functional form in DNA replication, 第21回 DNA 複製・組換え・ゲノム安定性制御ワークショップ, 2011.10. |
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荒牧 慎二, 青山 一弘, 真柳 浩太, 安永 卓生, 電子線クライオトモグラフィー法による神経細胞NG108-15の超微細構造観察, 第49回日本生物物理学会年会, 2011.09. |
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金 明月, 柳澤 春明, 小屋迫 光太郎, 神谷律, 真柳 浩太, 安永 卓生, クライオ電子線トモグラフィーによる遺伝的な重金属でラベルしたLC4の検出, 第49回日本生物物理学会年会, 2011.09. |
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真柳 浩太、清成 信一、西田 洋一、齊藤 美保子、神田 大輔、石野 良純、白井 剛、森川 耿右, 単粒子解析によるDNA 複製の制御機構の研究/
The regulation mechanism of DNA replication revealed by single particle analysis, 第１１回日本蛋白質科学会年会, 2011.06. |
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桑原 直之、橋本 博、小甲 裕一、池口 満徳、佐藤 衛、真柳 浩太、村山 泰人、岩崎 博史、清水 敏之, 相同組換えに関わるSwi5-Sfr1 複合体の構造機能解析/
Strucutual analysis of Swi5-Sfr1 complex, mediators for homologous recombination., 第１１回日本蛋白質科学会年会, 2011.06. |
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Kouta Mayanagi, Shinichi Kiyonari, Hirokazu Nishida, Mihoko Saito, Daisuke Kohda, Yoshizumi Ishino, Tsuyoshi Shirai, and Kosuke Morikawa, Molecular architecture of the PolB-PCNA-DNA complex as revealed by the electron microscopic single particle analysis, The 7th Global COE International Symposium & 6th Young Investigators Forum, 2011.02. |
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桑原直之，橋本博，小甲裕一，池口満徳，佐藤衛，真柳浩太，村山泰斗，岩崎博史，清水敏之, 相同組換えに関わるSwi5-Sfr1複合体の構造機能解析, 第33回日本分子生物学会年会、第83回日本生化学会大会, 2010.12. |
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藤野誠司，石野園子，井田梨沙，尾木野弘実，冨田宏矢，金井保，跡見晴幸，真柳 浩太，大山 拓次，森川 耿右，石野 良純, 超好熱性アーキアThermococcus kodakaraensisの複製フォーク複合体解明に向けてのMCM, GINS複合体解析, 第33回日本分子生物学会年会、第83回日本生化学会大会, 2010.12. |
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