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眞栁 浩太(まやなぎ こうた) データ更新日:2020.08.04



主な研究テーマ
電子顕微鏡によるDNA-蛋白質複合体の単粒子解析
キーワード:電子顕微鏡、単粒子解析、生体超分子、画像解析、構造生物
1991.04.
従事しているプロジェクト研究
JST 戦略的創造研究推進事業(さきがけ)、領域:「ライフサイエンスの革新を目指した構造生命科学と先端的基盤技術」、課題名:「DNA複製フォーク複合体の構築原理及び遷移・制御機構の解明」
2012.10~2016.03, 代表者:真柳浩太, 生体防御医学研究所.
研究業績
主要著書
1. 真柳浩太, 廣明秀一, 白井 剛 他, 構造決定法, 講談社, 2010.12.
2. 関口睦夫、森川耿右、楯真一、真柳浩太、藤博幸、日高真純、岡崎賢二、陣上久人、藤井郁雄, 生命の謎を解く —タンパク質研究からのアプローチ−, 共立出版, 2004.06.
主要原著論文
1. Kouta Mayanagi,Kazumi Saikusa, Naoyuki Miyazaki,Satoko Akashi, Kenji Iwasaki, Yoshifumi Nishimura, Kosuke Morikawa, Yasuo Tsunaka, Structural visualization of key steps in nucleosome reorganization by human FACT, Scientific Reports, 10.1038/s41598-019-46617-7., 9, 1, 10183, 2019.07, Facilitates chromatin transcription (FACT) is a histone chaperone, which accomplishes both nucleosome assembly and disassembly. Our combined cryo-electron microscopy (EM) and native mass spectrometry (MS) studies revealed novel key steps of nucleosome reorganization conducted by a Mid domain and its adjacent acidic AID segment of human FACT. We determined three cryo-EM structures of respective octasomes complexed with the Mid-AID and AID regions, and a hexasome alone. We discovered extensive contacts between a FACT region and histones H2A, H2B, and H3, suggesting that FACT is competent to direct functional replacement of a nucleosomal DNA end by its phosphorylated AID segment (pAID). Mutational assays revealed that the aromatic and phosphorylated residues within pAID are essential for octasome binding. The EM structure of the hexasome, generated by the addition of Mid-pAID or pAID, indicated that the dissociation of H2A-H2B dimer causes significant alteration from the canonical path of the nucleosomal DNA..
2. Takashima N, Ishino S, Oki K, Takafuji M, Yamagami T, Matsuo R, Mayanagi K, Ishino Y., Elucidating functions of DP1 and DP2 subunits from the Thermococcus kodakarensis family D DNA polymerase, Extremophiles, 10.1007/s00792-018-1070-3, 23, 1, 161-172, 2019.01.
3. Kouta Mayanagi, Sonoko Ishino, Tsuyoshi Shirai, Takuji Oyama, Shinichi Kiyonari, Daisuke Kohda, Kosuke Morikawa Yoshizumi Ishino , Direct visualization of DNA baton pass between replication factors bound to PCNA, Scientific Repots, 10.1038/s41598-018-34176-2, 8, 1, 16209, 2018.11, In Eukarya and Archaea, the lagging strand synthesis is accomplished mainly by three key factors, DNA polymerase (Pol), flap endonuclease (FEN), and DNA ligase (Lig), in the DNA replication process. These three factors form important complexes with proliferating cell nuclear antigen (PCNA), thereby constructing a platform that enable each protein factor to act successively and smoothly on DNA. The structures of the Pol-PCNA-DNA and Lig-PCNA-DNA complexes alone have been visualized by single particle analysis. However, the FEN-PCNA-DNA complex structure remains unknown. In this report, we for the first time present this tertiary structure determined by single particle analysis. We also successfully visualized the structure of the FEN-Lig-PCNA-DNA complex, corresponding to a putative intermediate state between the removal of the DNA flap by FEN and the sealing of the nicked DNA by Lig. This structural study presents the direct visualization of the handing-over action, which proceeds between different replication factors on a single PCNA clamp bound to DNA. We detected a drastic conversion of the DNA from a bent form to a straight form, in addition to the dynamic motions of replication factors in the switching process.
4. Mayanagi K, Ishino S Takafuji M, Mitsuoka K, Shirai T, Kiyonari S, Nishida H, Kohda D, Morikawa K, Ishino Y., Switching mechanism of DNA replication fork complex revealed by single particle analysis, European Microscopy Congress
, 3, 57-58, Vol3, 57-58, 2016.12.
5. Aramaki S, Mayanagi K, Jin M, Aoyama K, Yasunaga T, Filopodia formation by crosslinking of F-actin with fascin in two different binding manners, Cytoskeleton, 10.1002/cm.21309, 73(7):365-74, 2016.06.
6. Takekawa N, Terahara N, Kato T, Gohara M, Mayanagi K, Hijikata A, Onoue Y, Kojima S, Shirai T, Namba K, Homma M, The tetrameric MotA complex as the core of the flagellar motor stator from hyperthermophilic bacterium, Scientific Reports, 10.1038/srep31526, 6:31526, 2016.08.
7. Nakae S, Hijikata A, Tsuji T, Yonezawa K, Kouyama KI, Mayanagi K, Ishino S, Ishino Y, Shirai T, Structure of the EndoMS-DNA Complex as Mismatch Restriction Endonuclease, Structure, 24, 1960-1971, 24, 1960-1971, 2016.07, Archaeal NucS nuclease was thought to degrade the single-stranded region of branched DNA, which contains flapped and splayed DNA. However, recent findings indicated that EndoMS, the orthologous enzyme of NucS, specifically cleaves double-stranded DNA (dsDNA) containing mismatched bases. In this study, we determined the structure of the EndoMS-DNA complex. The complex structure of the EndoMS dimer with dsDNA unexpectedly revealed that the mismatched bases were flipped out into binding sites, and the overall architecture most resembled that of restriction enzymes. The structure of the apo form was similar to the reported structure of Pyrococcus abyssi NucS, indicating that movement of the C-terminal domain from the resting state was required for activity. In addition, a model of the EndoMS-PCNA-DNA complex was preliminarily verified with electron microscopy. The structures strongly support the idea that EndoMS acts in a mismatch repair pathway..
8. Mayanagi K, Kiyonari S, Nishida H, Saito M, Kohda D, Ishino Y, Shirai T, Morikawa K, , Architecture of the DNA polymerase B-proliferating cell nuclear antigen (PCNA)-DNA ternary complex. , PNAS, 108, 5, 1845-1849, (Corresponding Author), 2011.02.
9. Hirokazu. Nishida, Kouta. Mayanagi, Shinichi. Kiyonari, Yuichi. Sato, Takuji. Oyama, Yoshizumi. Ishino, Kosuke. Morikawa, Structural determinant for switching between the polymerase and exonuclease modes in the PCNA-replicative DNA polymerase complex, PNAS, 106, 20693-20698, 2009.11.
10. Kouta Mayanagi, Shinichi Kiyonari, Mihoko Saito, Tsuyoshi Shirai, Yoshizumi Ishino, Kosuke Morikawa, Mechanism of replication machinery assembly as revealed by the DNA ligase-PCNA-DNA complex architecture, PNAS, 106, 4647-4652, (Corresponding Author), 2009.03.
11. Yasuto Murayama, Yumiko Kurokawa, Kouta Mayanagi, and Hiroshi Iwasaki, Formation and branch migration of Holliday junctions mediated by eukaryotic recombinases, Nature, 451, 7181, 1018-1021, 2008.02.
12. Yoshie Fujiwara, Kouta Mayanagi, and Kosuke Morikawa, Functional significance of octameric RuvA for a branch migration complex from Thermus thermophilus., BBRC, 366, 2, 426-431, 2007.12.
13. Kouta Mayanagi, Yoshie Fujiwara, Tomoko Miyata, and Kosuke Morikawa, Electron microscopic single particle analysis of a tetrameric RuvA/RuvB/Holliday junction DNA complex, BBRC, 365, 273-278, (Corresponding Author), 2007.11.
14. Tomoko Miyata, Hirofumi Suzuki, Takuji Oyama, Kouta Mayanagi, Yoshizumi Ishino, and Kosuke Morikawa, Open clamp structure in the clamp-loading complex visualized by electron microscopic image analysis. , PNAS, 10.1073/pnas.0506447102, 102, 39, 13795-13800, 2005.09.
15. Tomoko Miyata, Takuji Oyama, Kouta Mayanagi, Sonoko Ishino, Yoshizumi Ishino, and Kosuke Morikawa, The Clamp-loading Complex for Processive DNA Replication, Nature Struct. & Molec. Biol. , 10.1038/nsmb788, 11, 7, 632-636, 2004.06.
16. Kyoko Matoba, Kouta Mayanagi, Syo Nakasu, Akihiko Kikuchi, and Kosuke Morikawa, Three-dimensional electron microscopy of the reverse gyrase from Sulfolobus tokodaii, BBRC, 297, 4, 749-755, 2002.10.
17. Naoko Kajimura, Matsuyo Yamazaki, Kosuke Morikawa, Akio Yamazaki, and Kouta Mayanagi, Three-dimensional structure of non-activated cGMP phosphodiesterase 6 and comparison of its image with those of activated forms, J. Struct. Biol., 139, 1, 27-38, (Corresponding Author), 2002.07.
18. Mayanagi, K., Miyata, T., Oyama, T., Ishino, Y., and Morikawa, K, Three-dimensional electron microscopy of the clamp loader small subunit from Pyrococcus furiosus, J. Struct. Biol., 134, 1, 35-45, (Corresponding Author), 2001.04.
19. Miyata, T., Yamada, K., Iwasaki, H., Shinagawa, H., Morikawa, K., and Mayanagi. K, Two different oligomeric states of the RuvB branch migration motor protein as revealed by electron microscopy, J. Struct. Biol., 131, 2, 83-89, (Corresponding Author), 2000.08.
20. Mayanagi, K., Ishikawa, T., Toyoshima, C., Inoue, Y., and Nakazato, K, Three-dimensional electron microscopy of the photosystem II core complex, J. Struct. Biol. , 123, 3, 211-224, 1998.11.
主要総説, 論評, 解説, 書評, 報告書等
1. 真柳浩太, 超分子複合体の電子顕微鏡単粒子解析, バイオサイエンスとインダストリー, 2005.06.
2. 真柳浩太、宮田知子, 電子顕微鏡によるDNA結合蛋白質複合体の単粒子解析, 細胞工学, 2001.10.
主要学会発表等
1. 津中 康央, 真柳 浩太, 七種 和美, 宮崎 直幸, 明石 知子, 岩崎 憲治, 西村 善文, 森川 耿右, FACTによって引き起こされるヘキサゾーム構造の電子顕微鏡解析, 2019.12.
2. 真柳 浩太,沖 啓輔,宮崎 直幸,石野 園子,山上 健,岩崎 憲治,森川 耿右,神田 大輔,白井 剛,石野 良純, クライオ電子顕微鏡によるPolD-PCNA-DNA複合体の構築様式及び切換え機構の解析, 第42回日本分子生物学会年会, 2019.12.
3. Kouta Mayanagi, Sonoko Ishino, Tsuyoshi Shirai, Takuji Oyama, Shinichi Kiyonari, Daisuke Kohda, Kosuke Morikawa, Yoshizumi Ishino, Direct Visualization of DNA Baton Pass between Replication Factors Bound to Archaeal Okazakisome., 15th International Congress on Thermophiles, 2019.09.
4. 真柳浩太, 沖啓輔, 石野園子, 宮崎直幸, 岩崎憲治, 神田大輔, 白井剛, 石野良純, クライオ電顕で「見る」古細菌複製フォーク複合体の機能構造, 第41回日本分子生物学会年会, 2018.11, DNAの複製には多数の蛋白質が関わり、一般的に互いに結合して複合体を形成し、その機能を担っている。これらの超分子複合体は柔軟な構造を持ち、構成因子を刻一刻とダイナミックに変化させるものも多く、結晶構造解析が一般的に困難である。個々の分子の実像が観察可能なクライオ電顕を用いた単粒子解析法は、このようなターゲットに対して非常に有効である。特に近年の「電子直接検出(DED)カメラ」の発展により、結晶構造解析に迫る分解能の解析が可能となり、大変に注目されている。我々はこれまで、構造解析に適した超好熱古細菌の系を中心に、レプリソームの機能構造連関を単粒子解析を用いて研究してきた。本講演では最新のク ライオ電顕技術を用いて得られたPolDとDNAクランプ、及び基質DNAから構成される複合体の構造的知見について報告する。 PolBが大変に良く研究されPCR等への応用が進んでいるのに対し、PolDは優れた伸長活性、校正反応活性を有しながら、特に構造に関する研究が進んでいない。近年、ようやく構成サブユニットDP1及びDP2の部分結晶構造が報告されたが、全体構造の解析例は皆無であり、サブユニット組成さえ未知である。PolDもPolB同様、生体中ではDNAクランプPCNAに結合することでその機能を活性化させる。 ゲル濾過により機能構造であるPolD-PCNA-DNA複合体を精製、凍結ロボットによって非晶質の氷中に包埋し、クライオ電子顕微鏡を用いて複合体の粒子像を撮影した。高感度、且つ高速の「動画撮影」が可能なDEDカメラを用い、さらに粒子像のコントラストを向上させる「位相板」を使用することで分解能の向上を図った。解析の結果、複合体の全体構造及びDP1、DP2の配置が明らかになった。また溶液中に2通りの構造が混在していることがわかった。両構造ともアルファーヘリックスが明確に可視化されており、更に結晶構造には含まれていない領域の可視化にも成功している。.
5. 真柳浩太, DNA-蛋白質複合体の単粒子解析, 生理研研究会2018, 2018.11, 我々はこれまで主にDNAの複製・修復・組換えや、転写に関わる超分子複合体の構造を単粒子解析を用いて解析してきた。これらの超分子複合体は、反応の各段階で構成因子の会合及び解離を適宜行うことで、適切に複合体を再編成させて、一連の反応を綿密に制御している。従ってその機構を理解するためには,個々の構成因子の結晶構造だけでは不十分であり、複合体全体の構造解析が必須であるが、DNAを含み且つこのように常に構造変化を伴う複合体の結晶化は容易ではない。「単粒子解析法」は、試料の結晶化の必要がなく、このような超分子複合体の立体構造解析に最適である。特に近年「電子直接検出カメラ」の開発により分解能が飛躍的に向上し、結晶構造解析と互角となっている。
 FACTはヌクレオソーム中のヒストンH2A/H2Bを引き抜くことでヌクレオソーム構造を破壊し、クロマチンのリモデリングを行う。近年、この反応を担うFACTのMidドメインとヒストンの結晶構造が2報発表されたが結果は一致せず、ヌクレオソーム全体との複合体の解析が待たれる状況であった。我々は収差補正機構を備えた最先端のクライオ電子顕微鏡、電子直接検出カメラ、位相板等を用いてMidドメインとヌクレオソームの構造解析を行った。対象となる粒子は16万〜20万程度とやや小さいため、特に位相板の使用が効果的であった。立体構造解析の結果、FACTとヌクレオソームの反応の生成物であるヘキサソームの構造が得られた。更に、MidのC末端から伸びる天然変性領域であるAIDセグメントがDNAと置き換わる形でヌクレオソームに侵入する様子を捉えることに成功し、ヌクレオソームの不安定化の機構の一端を明らかにすることができた。.
6. 真柳浩太, FACT-ヌクレオソーム複合体の単粒子解析, 第2回 エピジェネティック因子の構造と機能をつなぐ会, 2018.09.
7. 真柳浩太, クライオ電顕で見る超分子複合体の立体構造, 第42回蛋白質と酵素の構造と機能に関する九州シンポジウム, 2018.08, 近年、超解像技術の発展等により、細胞中の様々な因子の局在、動態については光学顕微鏡によって非常に詳細な情報がリアルタイムでモニター可能となっている。一方それら各因子の構造についても、おもに結晶構造解析による網羅的解析がなされ、既に膨大な原子座標データが蓄積されている。しかしながら、両者はその間に横たわるナノメータレンジの解析手段のギャップの存在によって、必ずしも有機的に結びつけられていない。
   生体内で蛋白質は、互いに結合して複合体を形成し、その機能を担っていることが多い。これらの超分子複合体はその構造、構成因子を刻一刻変化させるものも多く、またその大きさも正に前述のナノメータレンジに相当することから、これまで結晶構造解析などによる解析が一般的に困難であった。電子顕微鏡は細胞レベルから原子レベルまで、非常にワイドなスケールレンジを誇り、このギャップを埋め得る有望な手段である。特に個々の分子の実像を直視できる電子顕微鏡の特性を活かした、「単粒子解析法」は、試料の結晶化の必要がなく、超分子複合体の立体構造解析に最適である。
 本手法では生体超分子複合体を、急速凍結により溶液中の機能構造を保ったまま薄い氷中に保持し、電子顕微鏡で撮影した多数の粒子像から、計算機を用いてその立体構造を再構成する。その際、生体試料が一般的に電子線に脆弱であるため、電子線量を極度に下げた「暗い」撮影条件で画像を記録する必要があり、電子顕微鏡の装置自体は高分解能であるにも拘らず、これまで単粒子解析法による原子レベルの解析が大変に困難であった。
 実際、昨年ノーベル賞を受賞したR. Henderson博士は1995年に、分子量10万程度の複合体の画像を一万粒子ほど解析することで、3Åの原子分解能が得られると“予言”していたものの、5、6年前までメガダルトンを超えるリボソームのような巨大分子ですら、数十万〜数百万の粒子を解析しても原子分解能に到達するのが困難であった。
 近年、高感度で且つ高速の動画撮影が可能な「電子直接検出カメラ(DED)」が開発されたことにより、従来「静止画」で撮影していた電顕画像データを動画で撮影したところ、露光中に被写体である粒子が動いていたことが確認され、フレーム毎にこの動きを戻して補正することで、飛躍的に分解能が向上することが示された。このことにより、単粒子解析法は今では結晶構造解析と互角の分解能を実現できるまでになった。本講演ではこの単粒子解析法を概説したのち、本手法を用いて得られた成果等について報告する。
  我々はこれまで主にDNAの複製・修復・組換えや、転写に関わる超分子複合体の構造を単粒子解析を用いて解析してきた。これらの超分子複合体は、反応の各段階で構成因子の会合及び解離を適宜行うことで、適切に複合体を再編成させて、一連の反応を綿密に制御している。従ってその機構を理解するためには,個々の構成因子の結晶構造だけでは不十分であり、複合体全体の構造解析が必須であるが、DNAを含み且つこのように常に構造変化を伴う複合体の結晶化は容易ではない。そのため、個々の因子の結晶構造から全体の構造を組み上げて推察する方法も多くとられてきたが、我々が解析してきた単粒子解析による「全体」構造は多くの場合、これら提唱モデルと異なっていた。
1) オカザキソームの解析
 ラギング鎖の複製は主に3つの因子、ポリメラーゼ、フラップエンドヌクレアーゼ、リガーゼによって行われ、これらが順次切り替わることで、オカザキ断片の生成・連結が進行する。その際、ポリメラーゼを活性化するPCNAクランプが3量体であることから、3因子全てを同時に1つのPCNAクランプ上に保持し効率を向上させる「ツールベルトモデル」が提唱されていた。我々はこれまで、Pol-PCNA-DNA(参考文献5), Lig-PCNA-DNA(参考文献6), FEN-PCNA-DNA等の構造や、因子が切り替わる遷移状態のLig-FEN-PCNA-DNAの構造を解析してきたが、何れの結果も従来のモデルでは説明が困難であり、PCNAが単なる留め金ではなく、これまで考えられていた以上に因子の切り替えの制御に寄与している事が明らかになった。
2) ヌクレオソーム・リモデリング因子複合体の解析
 オカザキソームの解析には従来のCCDカメラを用いたのに対して、本サンプルはDEDカメラで解析を行った。またサンプルの大きさが20万程度と小さいため、このような対象に有効な「位相板」を活用した。その結果大幅に分解能を向上させることができ、ヌクレオソーム不安定化の機構を明らかにすることができた。.
8. Kouta Mayanagi, Keisuke Oki, Sonoko Ishino, Naoyuki Miyazaki, Kenji Iwasaki, Daisuke Kohda, Tsuyoshi Shirai, Yoshizumi Ishino , Single particle analysis of PolD‒PCNA‒DNA complex, 第40回日本分子生物学会年会, 2017.12, DNA polymerase PolB of the hyperthermophilic archaea is widely used in genetic engineering tools such as PCR, because of its outstanding stability under high temperature. All Archaea, except Crenarchaea have PolD in addition to PolB. Several recent studies have proved that PolD but not PolB is essential for genome replication. Though PolD has an excellent elongation as well as proofreading activity, it has never been applied to biotechnological tools such as PCR, due to the limited structural knowledge. Recently, the crystal structures of the core region of the PolD subunits DP1 and DP2 have been reported. However, the overall structure of PolD is not known in detail, till now.
We have successfully established a purification method of the full length PolD, and by mixing PCNA and primed DNA, we could purify the reconstituted PolD-PCNA-DNA complex, by gel filtration. The 3D structure of this complex was investigated by cryo electron microscopic single particle analysis. In order to improve the resolution of the 3D map, frozen hydrated samples were examined by Titan Krios cryo EM equipped with a Volta phase plate, and images were recorded with a direct electron detector (DED) camera.
The obtained 3D map exhibited not only the double helical structure of DNA, but also fine structures corresponding to the α helices of PolD. We could construct the atomic model of the whole complex by docking the individual crystal structures of PCNA, DP1, and DP2 into the obtained 3D map.
ave successfully established an purification method of the full length PolD, and by mixing PCNA and primed DNA, we could purify the reconstituted PolD-PCNA-DNA complex, by gel filtration. The 3D structure of this complex was investigated by cryo electron microscopic single particle analysis. In order to improve the resolution of the 3D map, frozen hydrated samples were examined by Titan Krios cryo EM equipped with a Volta phase plate, and images were recorded with an electron detector camera. The obtained 3D map exhibited not only the double helical structure of the DNA, but also fine structures corresponding to the α helices of the PolD. We could construct the atomic model of the whole complex by docking the individual crystal structures of PCNA, DP1, and DP2, into the obtained 3D map..
9. 真柳浩太, 電子顕微鏡で「見る」生体超分子の構造−革新的発展を続ける単粒子解析, JASIS 2017 ライフサイエンスイノベーション, 2017.09.
10. Kouta Mayanagi, Single particle analysis of DNA replication fork complex, 10th International 3R (DNA, Replication, Recombination, and Repair) Symposium, 2016.11,  We have been studying the mechanism of synthesis and maturation of Okazaki fragments, in which three replication factors, i.e. DNA polymerase, Flap endonuclease (FEN), and DNA ligase, are playing essential roles. As all of these three enzymes are known to interact with PCNA, a switching mechanism between these factors, bound simultaneously to a PCNA ring has been proposed, called PCNA tool belt model, which is considered to increase the efficiency of these sequential reactions. Recent biochemical studies, however, suggest sequential binding and releasing of these factors. Little is known regarding the precise switching mechanism, due to the lack of the structural knowledge of these complexes.
We investigated the structures of the core components of the replisome, such as DNA polymerase-PCNA-DNA, and DNA ligase-PCNA-DNA, by single particle analysis. Besides the known interaction through a PIP-box motif, we could find a novel contact between polymerase and PCNA, as well as between ligase and PCNA. Mutant analysis showed that these contacts are involved in the regulation of the replication factors, such as the switching between the polymerizing and editing modes of the polymerase. Our results, showing that both factors are bound to two subunits of the PCNA trimer, were inconsistent with the standard tool belt model. The third PCNA subunit, however, was still free in both complexes, thus we analyzed the complex structures with two replication factors. We could successfully visualize the 3D structure of FEN-DNA ligase-PCNA-DNA complex, and the handing over of the ds DNA from FEN to DNA ligase..
11. Mayanagi K, Ishino S Takafuji M, Mitsuoka K, Shirai T, Kiyonari S, Nishida H, Kohda D, Morikawa K, Ishino Y., Switching mechanism of the replisome as revealed by single particle analysis, 第 89 回日本生化学会大会, 2016.09, DNA replication in archaea and eukaryotes is executed by family B DNA polymerases, which exhibitfull activity when complexed with the DNA clamp, proliferating cell nuclear antigen (PCNA). PCNAhas a trimeric ring structure that encircles the DNA, and increases the processivity of the bound DNApolymerase by tethering it to the DNA. It is known now, that PCNA also interacts with multiple partnersto control DNA replication, DNA repair, and cell cycle progression, and works not only as the platform,but also as the conductor for the recruitment and release of these factors. However, the moleculararchitectures as well as the mechanism of the regulation of these replication factors are not known indetail.We have investigated the three-dimensional structure of the core components of the replisome,such as DNA polymerase-PCNA-DNA, and DNA ligase-PCNA-DNA ternary complexes, by singleparticle analysis (2- 3). Besides the authentic interaction through a PCNA-interacting protein box (PIPbox),we could find a novel contact between both polymerase-PCNA and ligase-PCNA. Mutant analysisshowed that these contacts are involved in the regulation of the replication factors, such as the switchingbetween the polymerizing and editing modes of the polymerase. Our results, showing that both factorsbound to two subunits of the PCNA trimer ring, were inconsistent with the standard tool belt model. Thethird PCNA subunit, however, was still free in both complexes, thus we analyzed the complex structureswith two replication factors bound to one PCNA ring, in order to investigate the switching mechanismbetween them in more detail..
12. Mayanagi K, Ishino S Takafuji M, Mitsuoka K, Shirai T, Kiyonari S, Nishida H, Kohda D, Morikawa K, Ishino Y., Switching mechanism of DNA replication fork complex revealed by single particle analysis, The 16th European Microscopy Congress, 2016.08.
13. Kouta Mayanagi, Molecular switching of DNA replication fork complex revealed by single particle analysis, The 1st APPA-PSSJ joint workshop, 2016.06, Okazaki fragments synthesis and maturation, during lagging strand DNA replication, is accomplished by mainly three replication factors, i.e. DNA polymerase, Flap endonuclease, and DNA ligase. All of these three enzymes are known to interact with the DNA clamp, proliferating cell nuclear antigen (PCNA), through a PCNA-interacting protein box (PIP-box) motif. PCNA forms a trimeric ring that encircles the DNA, and increases the processivity of the bound DNA polymerase by tethering it to the DNA. As up to three replication factors could be bound to a PCNA trimer, a switching mechanism between these replication factors, bound simultaneously to a PCNA ring has been proposed, called PCNA tool belt model, which is considered to increase the efficiency of the sequential reactions. However, the precise mechanism is not known in detail, due to the lack of structural data of such complexes. In order to investigate the mechanism of the regulation and switching of these replication factors bound to PCNA, we have studied the molecular architectures of the core components of the replisome, such as DNA polymerase-PCNA-DNA, and DNA ligase-PCNA-DNA complexes, by single particle analysis..
14. 真柳浩太, DNA複製フォーク複合体の構築原理及び遷移•制御機構の解明, さきがけ-ライフサイエンスの革新を目指した構造生命科学と先端的基盤技術- 研究領域 研究成果報告会, 2015.11.
15. 真柳 浩太, DNA複製フォーク複合体の分子構築及び切換え機構の研究, 蛋白研セミナー, 2014.02.
16. 真柳 浩太, DNA複製に関与する超分子複合体の単粒子解析, 日本顕微鏡学会第57回シンポジウム, 2013.11.
17. Kouta Mayanagi, Electron microscopic analysis of molecular architecture and switching mechanism of DNA replication fork complex, ICSG2013-SLS, 2013.07.
18. Kouta Mayanagi, Shinichi Kiyonari, Hirokazu Nishida, Sonoko Iahino, Mihoko Saito, Daisuke Kohda, Yoshizumi Ishino, Tsuyoshi Shirai, Kosuke Morikawa, Molecular architecture and switching mechanism of DNA replication fork complex, Gordon Research Conferences: Three Dimensional Electron Microscopy, 2013.06.
19. 真柳 浩太, 単粒子解析による複製関連複合体の制御機構の研究, 遺伝研研究集会, 2012.10.
20. Kouta Mayanagi, Molecular architecture and switching mechanism of DNA replication fork complex as revealed by single particle analysis, Structural Biology & DNA Repair (Current Opinion Conferences), 2011.10.
21. 真柳 浩太、清成 信一、西田 洋一、齊藤 美保子、神田 大輔、石野 良純、白井 剛、森川 耿右, 単粒子解析によるDNA 複製の制御機構の研究/
The regulation mechanism of DNA replication revealed by single particle analysis, 第11回日本蛋白質科学会年会, 2011.06.
22. Kouta Mayanagi, Shinichi Kiyonari, Hirokazu Nishida, Mihoko Saito, Daisuke Kohda, Yoshizumi Ishino, Tsuyoshi Shirai, and Kosuke Morikawa, Molecular architecture of the PolB-PCNA-DNA complex as revealed by the electron microscopic single particle analysis, The 7th Global COE International Symposium & 6th Young Investigators Forum, 2011.02.
23. 真柳浩太、西田洋一、清成信一、斉藤美保子、神田大輔、石野良純、白井剛、森川耿右, 電子顕微鏡単粒子解析による複製関連複合体の反応制御機構の研究, 第33回日本分子生物学会年会、第83回日本生化学会大会, 2010.12.
24. 真柳浩太, 西田洋一, 清成信一, 神田大輔, 白井 剛, 石野良純, 森川耿右, DNA Pol-PCNA-DNA複合体の電子顕微鏡単粒子解析, 第10回日本蛋白質科学会年会, 2010.06.
25. 真柳浩太, 単粒子解析によるDNA複製関連複合体の構造研究, 第51回 日本顕微鏡学会 九州支部総会・学術講演会, 2009.12.
26. K. Mayanagi, , N. Hirokazu, Y. Ishino, K. Morikawa, , Mechanism of replication machinery assembly as revealed by the single particle analysis of DNA ligase-PCNA-DNA complex, Gordon Research Conferences on Three Dimensional Electron microscopy, 2009.06.
学会活動
所属学会名
日本顕微鏡学会
日本蛋白質科学会
日本分子生物学会
日本生物物理学会
学協会役員等への就任
2006.04, 日本顕微鏡学会 生体構造解析分科会, 幹事.
学会大会・会議・シンポジウム等における役割
2011.05.15~2011.06.18, 日本顕微鏡学会第67回学術講演会, 座長(Chairmanship).
2008.12~2008.12, 日本生物物理学会第46回年会, 座長(Chairmanship).
2005.11.01~2005.11.02, 日本顕微鏡学会 第50回シンポジウム 医学生物系セッションII, 座長(Chairmanship).
2011.05.16~2011.05.18, 日本顕微鏡学会第67回学術講演会 「生体構造の電子線トモグラフィー解析」, オーガナイザー.
2011.05.19~2011.05.20, 日本顕微鏡学会 生体構造解析分科会 「生体構造トモグラフィー」ワークショップ, オーガナイザー、講師.
2005.11.01~2005.11.02, 日本顕微鏡学会 第50回シンポジウム 医学生物系セッションII, オーガナイザー.
学術論文等の審査
年度 外国語雑誌査読論文数 日本語雑誌査読論文数 国際会議録査読論文数 国内会議録査読論文数 合計
2020年度      
2012年度      
2011年度      
2010年度      
2009年度      
研究資金
科学研究費補助金の採択状況(文部科学省、日本学術振興会)
2020年度~2023年度, 基盤研究(B), 分担, 天然変性ヒストン様蛋白質による、結核菌の個性の創出と多様性獲得の分子機構.
2018年度~2020年度, 基盤研究(C), 代表, クライオ電子顕微鏡によるオカザキソームの機能構造連関の研究.
2016年度~2017年度, 新学術領域研究, 代表, 電子顕微鏡による染色体動態を担う超分子複合体の構築原理及び制御・遷移機構の研究.
2013年度~2015年度, 基盤研究(B), 分担, 生体分子構造データのグラフによる統一の試み.
2012年度~2015年度, 基盤研究(B), 代表, クランプによるレプリソームの制御機構の機能構造連関の研究.
2012年度~2013年度, 挑戦的萌芽研究, 代表, 電子顕微鏡による超分子複合体の構造解析用新規ラベル技術の開発.
2009年度~2011年度, 基盤研究(C), 代表, レプリソームの構築・再編成及び機能制御機構の構造生物学的研究.
競争的資金(受託研究を含む)の採択状況
2012年度~2015年度, 戦略的創造研究推進事業(さきがけ)「ライフサイエンスの革新を目指した構造生命科学と先端的基盤技術」, 代表, DNA複製フォーク複合体の構築原理及び遷移・制御機構の解明.
2008年度~2010年度, 科学技術振興機構 バイオインフォマティクス推進事業, 分担, 実践による超分子ネットワークモデリングシステムの開発.
2005年度~2008年度, 科学技術振興機構 バイオインフォマティクス推進事業, 分担, 実践による超分子複合体モデリングシステムの開発.
学内資金・基金等への採択状況
2009年度~2010年度, 九州大学教育研究プログラム研究拠点形成プロジェクト, 分担, 超高次複合体解析に基づくゲノム動態研究プロジェクト.

九大関連コンテンツ

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九州大学知的財産本部「九州大学Seeds集」